不同方法制備殼聚糖微囊形成機理初探

王 瑋,金鄰豫,白 穎,張海峰,許秋菊

(1.河南大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,河南 開封 475004;2.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院仿真實驗室,河南 開封 475004)

不同方法制備殼聚糖微囊形成機理初探

王 瑋1,金鄰豫2,白 穎1,張海峰1,許秋菊1

(1.河南大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,河南 開封 475004;2.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院仿真實驗室,河南 開封 475004)

目的:對不同方法制備殼聚糖微囊的成囊機理進(jìn)行初步探討。方法:采用單凝聚法、復(fù)凝聚法和乳化固化法分別制備殼聚糖微囊,結(jié)合傳統(tǒng)理論解釋,對相關(guān)影響因素進(jìn)行評價。結(jié)果:各種方法成囊機理不同,影響較大的因素也互不相同。結(jié)論:通過對這些方法制備殼聚糖微囊成囊機理的研究,可以為優(yōu)化殼聚糖微囊制備工藝提供理論依據(jù)和參考。

殼聚糖;微囊;形成;機理

殼聚糖(Chitosan,CS)是一種天然的陽離子聚合物,生物相容性好,具有生物黏附性;在體內(nèi)可被溶菌酶、胃蛋白酶等多種酶酶解,具有優(yōu)良的生物降解性和成膜性;有促進(jìn)傷口愈合、降血脂、降膽固醇等生物活性;對腫瘤細(xì)胞有選擇性吸附作用,可直接抑制腫瘤細(xì)胞,與抗癌藥物合用可增強抗癌作用等,因此它是一種優(yōu)良的微囊載體材料。近年來關(guān)于殼聚糖微囊制備的報道很多[1-2],但多側(cè)重于其具體的制備工藝,而對于其機理則較少報道。為此,本文以5-氟尿嘧啶為模型藥物和殼聚糖為囊材,分別采用了單凝聚法、復(fù)凝聚法和乳化固化法制備殼聚糖微囊,在此基礎(chǔ)上對其成囊機理進(jìn)行初步研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

殼聚糖(濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司,20061107);5-氟尿嘧啶原料藥(武漢合中生化制造有限公司,20080506);海藻酸鈉(天津信達(dá)化學(xué)試劑有限公司,20080311);無水CaCl2(上海晨光化學(xué)試劑有限公司,20071018);其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);YP-600型電子天平(上海第二天平儀器廠);SZ-93型自動雙重純化水蒸餾器(鞏義市英峪予華儀器廠);101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);EXSTAR-6000型熱分析系統(tǒng)(Seiko Instruments Inc.)等。

2 殼聚糖微囊形成機理傳統(tǒng)理論

2.1 降低殼聚糖溶解度

單凝聚法也叫沉淀法,屬于物理方法。殼聚糖只溶于稀酸溶液中,形成帶正電荷的聚電解質(zhì),其溶解性與溶液中存在的其他陰離子性質(zhì)密切相關(guān),當(dāng)溶液中存在醋酸鹽、乳酸鹽或谷氨酸鹽時殼聚糖的溶解度會提高[3],這種現(xiàn)象稱為鹽溶;當(dāng)存在磷酸鹽、聚磷酸鹽或硫酸鹽時,它們與水分子的親合力大于殼聚糖,溶液的離子強度發(fā)生改變,殼聚糖所帶正電荷被大量中和,從而降低了殼聚糖的溶解度使其沉淀析出,這種現(xiàn)象稱為鹽析。單凝聚法利用這個原理,向殼聚糖稀酸溶液中滴加沉淀劑(也稱凝聚劑)來制備。

2.2 相反電荷離子間相互作用

復(fù)凝聚法是利用2種相反電荷的高分子材料以離子間相互作用而交聯(lián)形成復(fù)合微球或微囊,也屬于一種物理方法。由于殼聚糖的酸性水溶液帶正電荷,因此可以選用任何陰離子聚合物來與其復(fù)合。目前常用的與殼聚糖復(fù)凝聚的材料是海洋多糖海藻酸鈉[4],其次是酪蛋白和明膠。海藻酸鈉的固化主要是靠Ca2+,與殼聚糖之間的離子作用是輔助性的。

2.3 形成乳液后交聯(lián)固化

乳化-固化法是制備生物降解性高分子、天然高分子微球或微囊最常用的方法。其機理是首先用各種乳化方法制備乳液,然后用除去溶劑的方法使分散相固化。針對不同的包封物和聚合物材料,所采用的具體方法也不同。本課題研究的內(nèi)包物和囊材均為水溶性物質(zhì),此時一般采用 W/O型乳液,將聚合物和內(nèi)包物溶解于水,使其分散于油相制成W/O型乳液,然后通過對聚合物交聯(lián)得到微囊。

3 不同方法制備CS微囊機理的探討

3.1 單凝聚法

3.1.1 制備方法 稱取一定量的殼聚糖,充分溶解于體積分?jǐn)?shù)為2%稀醋酸中,配成殼聚糖醋酸溶液。量取20mL該液于燒杯中,加入100mg的5-氟尿嘧啶,使溶解完全,加入表面活性劑1mL于恒溫磁力攪拌器中,保持溫度為50℃,開始攪拌30min,加入NaOH溶液調(diào)p H值為5.5,加入凝聚劑,攪拌中再加入稀釋劑,20min后加入戊二醛溶液(體積分?jǐn)?shù)為5%)0.5mL,開始固化 2 h后 ,洗滌,抽濾,干燥 ,即得。

3.1.2 機理探討 由單凝聚法的原理可知,該法主要是通過降低CS的溶解度而凝聚成囊。影響CS膠凝的主要因素有濃度、溫度、電解質(zhì)和交聯(lián)劑等。

3.1.2.1 殼聚糖濃度和黏度對成囊的影響 按照

3.1.1項下實驗方法的設(shè)定,其他條件相同的情況下改變殼聚糖濃度,考察該因素對成囊的影響(表1)。由表1所示,當(dāng)殼聚糖濃度在0.1%～0.5%左右時候,能形成均勻的圓形微囊,且粒徑隨著濃度的升高而增大。隨著殼聚糖濃度升的更高時,殼聚糖醋酸溶液的黏度將會增加,不易成囊。

表1 殼聚糖濃度對成囊情況的影響

3.1.2.2 溫度對成囊的影響 按照3.1.1項下實驗方法的設(shè)定,其他條件相同的情況下改變反應(yīng)體系溫度,考察該因素對成囊的影響(表2)。由表2所示,當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃時該反應(yīng)體系所成的微囊包封率理想,微囊粒徑均一度高。當(dāng)溫度太高時,由于溶劑蒸發(fā),形成局部濃度過濃,囊材相互凝聚而不能成囊。在顯微鏡下可見殼聚糖成絮狀凝出。如溫度太低,由于囊材相互之間不能很好融熔,因此成囊也不理想。當(dāng)凝聚成囊后,必須使其在較低的溫度下膠凝。

表2 溫度對成囊情況的影響

3.1.2.3 凝聚劑對成囊的影響 電解質(zhì)對膠凝的影響,陰離子起主要作用,其電荷數(shù)愈高膠凝作用愈強。常見的陰離子中,促進(jìn)膠凝的作用最強,Cl-次之,而SCN-則可阻止膠凝。據(jù)此,本文所選用的凝聚劑是Na2SO4,所需加入的量與所使用的殼聚糖的分子量有關(guān),隨著分子量的增加而增加。

3.1.2.4 交聯(lián)劑對成囊的影響 如不加入交聯(lián)劑固化,在沉淀微囊時,藥物易擴散到微囊外的水相,導(dǎo)致微囊對藥物的包封率不很高。凝聚囊的固化可用囊材的理化性質(zhì)不同而選擇不同的交聯(lián)劑,采用殼聚糖為囊材時,一般采取醛類,如甲醛、戊二醛等,溫度一般控制在0～5℃。甲醛導(dǎo)致交聯(lián)的程度與許多因素有關(guān),一般在濃度大、時間長、介質(zhì)p H8～9時交聯(lián)才能完全。若囊心物在堿性介質(zhì)不穩(wěn)定時,可用體積分?jǐn)?shù)為5%戊二醛,后者在中性介質(zhì)中也能完成交聯(lián),其交聯(lián)作用可采用席夫反應(yīng)(Schiff’s reaction)表示,線性高分子囊材通過化學(xué)反應(yīng)聯(lián)接成網(wǎng)狀或體型高聚物,形成一層致密的保護(hù)膜而包封芯材形成微囊,使其具有一定強度。按照3.1.1項下實驗方法的設(shè)定,其他條件相同的情況下改變反應(yīng)中戊二醛的量,考察該因素對成囊的影響(表3)。由表3所示,若交聯(lián)不足則微囊易粘連,若交聯(lián)過度,所得微囊脆性太大。

表3 戊二醛用量對成囊情況的影響

3.2 復(fù)凝聚法

3.2.1 制備方法 首先用體積分?jǐn)?shù)為2%的醋酸溶液配制0.6mol/L CaCl2的醋酸溶液200mL,然后加入一定量、一定規(guī)格的殼聚糖,攪拌溶解,過濾,室溫靜置過夜。稱取一定量海藻酸鈉溶解于200mL蒸餾水中,再加入稱好的一定量的5-氟尿嘧啶。以此溶液作為水相,滴入 50mL植物油(含2.5mL/Span-80)乳化10min,得W/O型乳液。然后將以上制得的殼聚糖溶液用連接8號針頭的注射器緩慢滴加到乳液中,以500 r/min的速度攪拌30min,室溫靜置12 h。用石油醚除去油相,微囊用石油醚、異丙醇分別洗滌3次,抽濾,真空干燥即得5-fu-海藻酸鈉-殼聚糖微囊。

3.2.2 機理探討 將被包埋藥物溶于海藻酸鈉溶液中,然后將該溶液滴加進(jìn)含離子交聯(lián)劑CaCl2的殼聚糖溶液中[5],海藻酸鹽將變成不溶的海藻酸鈣而固化成微囊,同時與殼聚糖形成離子聚合體,使殼聚糖吸附在海藻酸鈣微囊的表面或進(jìn)入內(nèi)部。為探討5-氟尿嘧啶-殼聚糖復(fù)合微囊形成機理,對5-氟尿嘧啶、海藻酸鈉、殼聚糖和復(fù)合微囊進(jìn)行DSC分析,所得的譜圖見圖1和圖2。

圖1 殼聚糖與復(fù)合微囊的DSC圖

圖2 海藻酸鈉和5-氟尿嘧啶的DSC譜圖

由圖1、圖2可以看出,荷負(fù)電的海藻酸鈉、荷正電的殼聚糖在其最終的反應(yīng)產(chǎn)物的DSC譜中自身的特征峰均消失,最終產(chǎn)物出現(xiàn)了新特征峰,說明各組分不是以各自獨立的形式存在于產(chǎn)物中,它們之間發(fā)生了靜電作用,以新的相互結(jié)合狀態(tài)存在。經(jīng)考察,各種影響殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合微囊成囊的因素如下:①殼聚糖的脫乙酰度對成囊的影響:按照3.2.1實驗方法的設(shè)定,在其他條件相同的情況下使用不同脫乙酰度[5]的殼聚糖,考察該因素對成囊的影響(表4)。由表4可以看出,脫乙酰度越大越不利于微囊的形成,因為脫乙酰度越大,殼聚糖的黏度越小,殼聚糖的陽離子電荷密度也就越大,不利于與荷負(fù)電的海藻酸鈉發(fā)生靜電交聯(lián)反應(yīng)。②殼聚糖和海藻酸鈉的濃度對成囊的影響:實驗的結(jié)果表明,在進(jìn)行最佳制備條件優(yōu)化時,只有當(dāng)復(fù)凝聚的兩種物質(zhì)電荷相等時,才能獲得最大收率,其中當(dāng)殼聚糖的濃度小于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時不能成囊,而且殼聚糖和海藻酸鈉的濃度也不能過高,粒徑會隨濃度的提高而增加,微囊不能分散開,且有較大面積的粘連;③p H對成囊的影響:海藻酸鈉易溶于水,是一種電荷密度很高的聚電解質(zhì)。由實驗可以看出,p H值是影響成囊的一個重要條件,主要是因為隨著反應(yīng)體系的p H值的變化,體系中的-和-COO-基團(tuán)的數(shù)目會相應(yīng)發(fā)生變化。當(dāng) p H接近海藻酸鈉的 p Ka時,其界面上-COO-基團(tuán)的濃度很高,暴露的-COO-基團(tuán)很少,而微囊囊膜的形成主要發(fā)生在海藻酸鈉的-COO-和殼聚糖的-之間,殼聚糖與海藻酸鈉的絡(luò)合程度因此而增強或減弱。當(dāng)殼聚糖溶液的p H<5.50時,影響殼聚糖鍵合程度的主要因素是殼聚糖分子的電荷數(shù)量;當(dāng)p H>5.50時,尤其是當(dāng)接近其等電點時,影響殼聚糖鍵合程度的主要因素是殼聚糖分子的空間結(jié)構(gòu)。

表4 脫乙酰度對成囊情況的影響

3.3 乳化固化法

由于殼聚糖溶于稀酸溶液,因此采用W/O型和O/W/O型乳液固化法分別包埋水溶性和脂溶性藥物。乳液的固化方法是蒸去殼聚糖溶液中的水分使微球或微囊固化,也可使用化學(xué)交聯(lián)或物理交聯(lián)的方法來固化。由于殼聚糖帶有氨基,因此采用化學(xué)交聯(lián)法進(jìn)行固化是經(jīng)典且常用的制備方法。本文使用的模型藥物是5-氟尿嘧啶,屬于水溶性藥物,因此要首先制備W/O型乳液,制成乳液后加入戊二醛使其擴散進(jìn)入殼聚糖水相,使殼聚糖交聯(lián)成微囊或微球。親水性藥物則均勻地分散在微囊或微球中,如果是脂溶性藥物則被包埋在殼聚糖微囊內(nèi)的各個小空腔內(nèi),釋藥時必須先擴散進(jìn)入殼聚糖內(nèi),再擴散至微囊外,因此兩者將顯示不同的藥物釋放行為和釋放速度。由兩種藥物的油水分配系數(shù)可知,水溶性藥物的釋放速度將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于脂溶性藥物。以下為探討各種影響乳化固化法制備微囊的因素。

3.3.1 制備方法 取15mL一定濃度的殼聚糖醋酸(體積分?jǐn)?shù)為2%)溶液,置于250mL燒杯中,一次加入一定量的5-氟尿嘧啶,2 g的span80,60mL的液體石蠟,以1000 r/min的轉(zhuǎn)速開始攪拌,20min后進(jìn)行超聲處理,10min后傾入60mL乙醚液(含有一定量戊二醛)中,以800 r/min繼續(xù)攪拌2 h,經(jīng)石油醚、正丁醇洗滌后,干燥,即得。

3.3.2 機理探討

3.3.2.1 殼聚糖濃度對成囊的影響 按照3.3.1實驗方法設(shè)定,其他條件相同的情況下改變殼聚糖濃度,考察該因素對成囊的影響(表5)。由表5可以看出,殼聚糖濃度過小時,制得的微囊形狀不好,強度較差,容易粘連;殼聚糖濃度過大時,殼聚糖溶液黏度大,不易分散,且生成的粒徑較大,包封率也有提高。

表5 殼聚糖濃度對成囊情況的影響

3.3.2.2 戊二醛用量對成囊的影響 按照3.3.1實驗方法的設(shè)定,其他條件相同的情況下改變反應(yīng)中戊二醛的量,考察該因素對成囊的影響,結(jié)果如表6所示,其中交聯(lián)度為戊二醛的醛基與殼聚糖的氨基之比。由表6可知,戊二醛在進(jìn)行交聯(lián)固化的時候,交聯(lián)度越大,交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的孔徑越小,對藥物小分子的包裹越緊密,表現(xiàn)為包封率越大。

表6 戊二醛用量對成囊情況的影響

3.3.2.3 芯壁比對成囊的影響 按照3.3.1實驗方法的設(shè)定,其他條件相同的情況下改變反應(yīng)中的芯壁比,考察該因素對成囊的影響(表7)。由表7可知,隨著芯壁比的增加,包封率降低,載藥量升高。

表7 戊二醛用量對成囊情況的影響

4 討論

4.1 單凝聚法制備殼聚糖微囊的形成機理及對其影響因素的評價

影響高分子囊材膠凝的主要因素有濃度、溫度、電解質(zhì)和交聯(lián)劑等。采用單凝聚法制備殼聚糖微囊時,濃度不能過高,一般控制在0.1%～0.5%之間;反應(yīng)溫度一般控制在50℃左右,交聯(lián)固化溫度一般控制在0～5℃;凝聚劑加入的量與殼聚糖的分子量成正比的關(guān)系;若交聯(lián)不足則微囊易粘連,若交聯(lián)過度,所得微囊脆性太大。

4.2 復(fù)凝聚法制備殼聚糖微囊的形成機理及對其影響因素的評價

脫乙酰度越大越不利于微囊的形成;當(dāng)復(fù)凝聚的兩物質(zhì)的電荷相等時,才能獲得最大的收率;p H值是影響成囊的一個重要條件,一般應(yīng)控制在3～6之間。

4.3 乳化固化法制備殼聚糖微囊的形成機理及對其影響因素的評價

殼聚糖濃度在過小或過大時均不能得到分散均勻、外觀好的微囊,實驗的結(jié)果表明其在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%～3.5%之間時比較理想;交聯(lián)度越大,包封率越大;隨著芯壁比的增加,包封率降低,載藥量升高。

通過對殼聚糖微囊形成機理的研究,將為優(yōu)化殼聚糖微囊的制備工藝提供理論依據(jù)和參考,并為工廠大量生產(chǎn)帶來實際價值。

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[責(zé)任編輯 姬 荷]

Preliminary study on the possible mechanisms of chitosan microcapsules prepared by various methods

WANG Wei1,JIN Lin-yu2,BAI Ying1,ZHANG Hai-feng1,XU Qiu-ju1(1.Pharmaceutical College of Henan University,Kaifeng,Henan475004,China;2.Chemistry&Chemical Engineering College of Henan University,Kaifeng,Henan475004,China)

Objective:To study the possible mechanisms of chitosan microcapsules prepared by variousMethodspreliminarily.Methods:Some chitosan microcapsules were prepared by monophasic coagulation method,complex coacervation method and emulsion crosslinking method,then the evaluation of related factors were conducted through the traditional theory.Results:The sacculation mechanism model and factors varies with different preparation methods.Conclusion:The research on the possible mechanisms will provide a theoretical basis and reference for optimizing technique to prepare chitosan microcapsules.

chitosan;microcap sules;form;mechanism

O636

A

1672-7606(2010)04-0253-05

2010-09-12

河南大學(xué)校內(nèi)基金項目(04YBRW060)

王瑋(1964-),男,河南 開封 人,博士,碩士生導(dǎo)師,教授,從事藥物緩控釋與微粒靶向制劑的研究工作。