HEK293、COS7、7721、Hep G2和 PC12細胞內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂合成酶活性比較

朱 珂,孫國濤,秦 睿,石淵淵

(河南大學醫(yī)學院分子醫(yī)學研究所,河南 開封 475004)

HEK293、COS7、7721、Hep G2和 PC12細胞內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂合成酶活性比較

朱 珂,孫國濤,秦 睿,石淵淵＊

(河南大學醫(yī)學院分子醫(yī)學研究所,河南 開封 475004)

目的:分析比較 HEK293、COS7、7721、Hep G2和 PC12的細胞內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂合成酶(SMS)的活性。方法:收集處于對數(shù)生長期的 HEK293、COS7、7721、Hep G2和PC12細胞,每種細胞的細胞濃度相同;5種細胞均建立2個酶促反應體系,反應時間分別是2 h和3.5 h;薄層層析和灰度掃描分析比較SMS活性強弱。結(jié)果:HEK293細胞內(nèi)的SMS活性較強。結(jié)論:建立了有效檢測不同來源細胞SMS活性比較的方法,發(fā)現(xiàn) HEK293細胞具有較強的SMS活性,可以更好的用于神經(jīng)鞘磷脂代謝的研究。

神經(jīng)鞘磷脂;薄層層析;神經(jīng)鞘磷脂合成酶;脂筏

神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin,SM)是人體內(nèi)含量最多的鞘磷脂,是構(gòu)成生物膜的重要組分。神經(jīng)鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase,SMS)是合成SM途徑中的最后一個酶,它催化卵磷脂(Phosphatidylcholine,PC)和神經(jīng)酰胺(ceramide,Cer)生成SM和甘油二脂(Diacylglycerol,DAG)。SMS的底物神經(jīng)酰胺和產(chǎn)物甘油二酯是細胞內(nèi)重要的信息物質(zhì),在炎癥的發(fā)生、細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)中起重要的生物學作用。細胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺增加細胞膜的流動性,參與構(gòu)成脂筏與細胞膜內(nèi)陷,部分磷酸化后還可能參與了細胞的吞噬作用[1-2];DAG通過信號轉(zhuǎn)導途徑導致細胞增生或核型變化,引起細胞持續(xù)增生,誘導癌變。

有研究顯示[3],SMS高表達對SM水平有調(diào)節(jié)作用;高表達SMS還有抗凋亡作用[4-5]。另有研究顯示,采用RNAi技術抑制細胞內(nèi)的SMS的表達后,細胞內(nèi)的SM生成減少,神經(jīng)酰胺堆積,TNF-α誘導的凋亡顯著性升高[6]。此外,通過RNAi技術抑制細胞內(nèi)SMS的表達后,細胞生長受抑制,然后再向此細胞內(nèi)加入外源性的SM,細胞并不能恢復生長,說明SMS除了合成SM外,還參與調(diào)節(jié)細胞的生長和凋亡[7]。本文通過薄層層析法比較5種細胞內(nèi)的SMS的活性,為以后深入研究SM奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

HEK293細胞由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學細胞中心提供;COS7、7721、HepG2和PC12細胞購于上海細胞庫;NBD-SM為Molecular probes公司產(chǎn)品;NBD-ceramide、Phosphatidylcholine為 Sigma公司產(chǎn)品;MEM和DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品;薄層層析板為Whatman公司產(chǎn)品。

A/B3生物安全柜(Thermo Forma);TS100倒置顯微鏡(Nikon);HERA CELL二氧化碳培養(yǎng)箱(德國);IS-2200凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha)。

1.2 實驗過程

1.2.1 細胞培養(yǎng) HEK293、COS7、7721、HepG2 和PC12細胞生長于含體積分數(shù)為10%的胎牛血清和80 IU/mL硫酸慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.2.2 收集細胞 收集處于對數(shù)生長期的細胞,調(diào)細胞濃度,即每毫升細胞懸液90×104個,每種細胞約450×104個細胞。

1.2.3 提取細胞粗酶液 細胞懸液4000 rpm,10min離心,棄上清。每種細胞加入250μL勻漿液,重懸浮細胞。用玻璃勻漿器在冰上勻漿,收集勻漿液于離心管內(nèi)離心4000 rpm,10min,收集上清于一新的離心管內(nèi),即是細胞粗酶液。

1.2.4 建立SMS反應體系 取粗酶液依次加入底物卵磷脂、NBD-神經(jīng)酰胺和SMS反應緩沖液。每種細胞建立2組反應體系,置37℃恒溫箱反應。一組反應2 h,另一組反應3.5 h。

1.2.5 層析 用氯仿/甲醇抽提有機相于一新的離心管內(nèi),自然揮干。再用氯仿溶解,點樣于層析板,在氯仿-甲醇-氨水-水組成的展開體系里層析8min。

1.2.6 成像系統(tǒng)拍照 將層析板放入成相系統(tǒng)拍照。灰度掃描,分析。

2 結(jié)果

2.1 實驗結(jié)果

酶反應體系中,在SMS的作用下,神經(jīng)酰胺的C-1羥基上連接了磷酸膽堿生成SM,由于底物NBD-神經(jīng)酰胺帶有綠色熒光染料,生成的產(chǎn)物SM也帶有綠色熒光染料,用帶有綠色熒光染料的NBD-SM作標準,薄層層析法測SMS酶活性,經(jīng)凝膠圖像分析儀掃描,反應時間為2h和3.5 h的SMS活性強弱,結(jié)果如圖1,圖2所示。從左至右依次是 NBD-SM、HEK293、COS7、7721、HepG2和PC12細胞的SMS活性圖譜。

圖1 反應時間2 h神經(jīng)鞘磷脂合成酶活性層析圖譜

圖2 反應時間3.5 h神經(jīng)鞘磷脂合成酶活性層析圖譜

圖3 反應時間2 h凝膠圖像灰度分析結(jié)果

圖4 反應時間3.5 h凝膠圖像灰度分析結(jié)果

2.2 結(jié)果分析

SMS酶活性凝膠圖像經(jīng)灰度分析,結(jié)果如圖3、圖4。反應時間2h時,HEK293的SMS活性是COS7的1.06倍、是7721的1.72倍、是 HepG2的1.92倍、是PC12的3.74倍。反應時間3.5 h時,HEK293的SMS活性是 COS7的1.51倍、是7721的1.72倍、是HepG2的1.76倍、是PC12的5.02倍。

3 討論

HEK293是人胚腎細胞轉(zhuǎn)化5型腺病毒DNA得到的細胞株。COS7是來源于非洲綠猴腎成纖維細胞并經(jīng)SV40病毒基因轉(zhuǎn)化的細胞株。7721與 HepG2是人肝腫瘤細胞株。PC12細胞株來源于鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤,是一個常用的神經(jīng)細胞株。實驗結(jié)果顯示,HEK293、COS7、7721、HepG2 和 PC125 種細胞的SMS的活性依次減弱。SMS是SM合成的關鍵酶,SM、膽固醇和鞘磷脂等參與構(gòu)成細胞膜脂筏。最近研究發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)大約65%的SM存在于脂筏內(nèi)[8],脂筏微區(qū)將不同的信號分子積聚在同一區(qū)域,促進了它們之間的相互作用和信號轉(zhuǎn)導通路的激活;SMS調(diào)節(jié)脂筏中的SM的水平和脂筏的功能,介導內(nèi)吞、凋亡等[9-10],并影響DAG和神經(jīng)酰胺的代謝[11]。無論上調(diào)或下調(diào)SMS活性都與有絲分裂和促凋亡信號介導有著直接的關聯(lián)[12]。SMS以及SM對細胞生命活動有著重要的意義,在本實驗中,采用薄層層析法,比較不同來源的細胞在2個時間點的SMS活性,發(fā)現(xiàn)SMS活性測定在2～3.5 h內(nèi)穩(wěn)定、可靠。籍此我們建立了有效的方法,鑒別不同來源的細胞系的SMS的活性。通過對不同細胞來源的細胞進行比較,我們發(fā)現(xiàn)HEK293細胞具有更高的SMS活性,可以更好地用于SM代謝的研究。

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[責任編輯 時 紅]

Comparison of the sphingomyelin synthase activities in HEK293,COS7,7721,HepG2 and PC12 cells

ZHU Ke,SUN Guo-tao,QIN Rui,SHI Yua-yuan＊(Medical College ofHenan University,Institute ofmolecular Medicine,Kaif eng,Henan475004,China)

Objective:T o analyze and compare the activities in HEK293,COS7,7721,HepG2 and PC12 sphingomyelin synthase(SMS)which were commonly used in medical research.Methods:The HEK293、COS7、7721、HepG2 and PC12 cells was collected in each logarithmic phase,the concentration of which was the same.2 zymo-exciter systems was established by 5 kinds of cells.The activities of SMS were tested and compared at 2h and 3.5h.The SMS activities were analyzed and compared for their strength and weakness with thin layer chromatographic(TLC).Results:The SMS activity of HEK293 is the highest in HEK293 cells.Conclusion:In this study,an effective method was established to compare the activities of sphingomyelin synthase in different cell lines.The HEK293 cells has stronger SMS activity which means it can be better used in sphingomyelin research.

sphingomyelin synthase;thin layer chromatographic;sphingomyelin;lipid rafts

Q545.3

A

1672-7606(2010)04-0275-03

2010-08-30

國家自然科學基金項目(30800175);河南省教育廳自然科學基金項目(2006180004)

朱珂(1984-),男,河南周口人,碩士研究生,從事脂代謝與糖尿病的研究工作。

＊通訊作者:石淵淵(1951-),女,河南濟源人,教授,從事脂代謝與動脈粥樣硬化的研究工作。