RP-HPLC法測(cè)定老年咳喘片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量

覃建明，莫文電（1.廣西河池市人民醫(yī)院藥劑科，河池市 547000；.廣西河池市藥品檢驗(yàn)所，河池市547000）

老年咳喘片由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、甘草、黃精、淫羊藿、補(bǔ)骨脂制成，具有滋陰壯陽、扶正固本的功效，可以提高人體免疫能力，促進(jìn)病體康復(fù)，用于治療老年慢性支氣管炎及各種體虛癥。補(bǔ)骨脂含香豆精類、黃酮類、單萜酚類以及揮發(fā)油、皂苷、多糖、類脂等成分。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為香豆精類，在補(bǔ)骨脂中含量較高。因此，筆者選取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素作為定量指標(biāo)來控制本品質(zhì)量，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法[1～4]測(cè)定其含量，并證明該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可用于老年咳喘片的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

LC-10ATVPHPLC儀、SPD-10AVP紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；威瑪龍色譜數(shù)據(jù)工作站（深圳深軟電子有限公司）。

1.2 試藥

補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào):110739-200613）、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào):110738-200410）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；老年咳喘片（規(guī)格:基片重0.3 g；批號(hào):080101、081002、081201、090301等10批）及缺補(bǔ)骨脂的陰性樣品由廣西某藥廠提供；甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相:甲醇-水（55∶45）；流速:1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng):246 nm；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL各含20μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率160 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取不含補(bǔ)骨脂的陰性樣品，照“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按上述色譜條件各進(jìn)樣10μL，分別記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液在與對(duì)照品溶液補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素峰的保留時(shí)間處有相應(yīng)的色譜峰，均達(dá)到基線分離；陰性對(duì)照溶液無補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的吸收峰。色譜見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品9.4 mg、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品9.2 mg，置同一100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。精密量取此貯備液0.5、1、2、5、10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為Y補(bǔ)骨脂素＝7.121 1×106X+5.196 9×103（r＝0.999 9）；Y異補(bǔ)骨脂素＝7.158 9×106X+5.149 5×103（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，二者進(jìn)樣量依次在0.047 0～0.940 0、0.046 0～0.920 0 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為0.87%、0.63%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取室溫放置的同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、12 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的峰面積。結(jié)果，二者RSD依次為1.65%和1.02%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào):090301）樣品6份，同法測(cè)定。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素的平均含量為0.116 mg·g-1，RSD＝0.93%；異補(bǔ)骨脂素的平均含量為0.125 mg·g-1，RSD＝0.81%，表明方法重復(fù)性良好。

2.10 耐用性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，用2根不同廠家的C18色譜柱（另一根色譜柱為依利特C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）分別以流速0.8、1.0、1.2 mL·min-1進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD依次為1.04%、1.13%（n＝6），表明方法耐用性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào):090301）9份，分成3組，按高、中、低3個(gè)不同濃度分別精密加入一定量的混合對(duì)照品貯備液，水浴蒸干，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依上述方法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，補(bǔ)骨脂的平均回收率為97.70%，RSD＝0.89%（n＝9）；異補(bǔ)骨脂素的平均回收率為98.76%，RSD＝0.84%（n＝9）。

2.12 樣品含量測(cè)定

取10批樣品，按上述色譜條件進(jìn)樣，依法測(cè)定含量，每批測(cè)定3份，結(jié)果見表1。

表1 樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 1 Content determination of psoralen and isopsoralen in Laonian kechuan tablets（n＝3）

2.13 含量限度的擬訂

按正文擬訂的含量測(cè)定方法測(cè)定本品10批樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量，發(fā)現(xiàn)2種成分含量比例差別較大，結(jié)合實(shí)際考慮，以總含量來擬訂測(cè)定限度。10批樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總含量分別是每片77.0、63.3、70.3、64.6、57.6、77.1、80.5、58.2、79.8、72.7 μg，其中總含量最高的是每片80.5 μg，最低的是每片57.6 μg，平均總含量為每片70.1 μg。因此，擬訂本品每片含補(bǔ)骨脂以補(bǔ)骨脂素（C11H6O3）和異補(bǔ)骨脂素（C11H6O3）計(jì)，總量不得少于60 μg。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，分別加流動(dòng)相使溶解，在紫外分光光度計(jì)上掃描。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素對(duì)照品在246.2 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品在246.4 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇246 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取溶劑及提取條件的選擇

根據(jù)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素易溶于甲醇、乙醇等溶劑的物理特性，本試驗(yàn)選用甲醇作為提取溶劑；經(jīng)回流和超聲處理比較，結(jié)果用甲醇為溶劑超聲處理，可達(dá)到完全提取的目的。通過對(duì)超聲時(shí)間15、30、40、50 min的考察，發(fā)現(xiàn)提取40 min與50 min時(shí)樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量無明顯差別，故選用超聲提取40 min。

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