HPLC法同時測定夏枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量Δ

郭淑英，馮波（吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，長春市132013）

夏枯草（Prunella vulgarisL.）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，因“此草夏至后即枯”而得名，2005年版《中國藥典》記載的夏枯草是唇形科夏枯草屬植物的干燥果穗[1]。夏枯草主要含有三萜及其苷類、苯丙素類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、有機酸、揮發(fā)油及糖類等成分。其中，齊墩果酸和熊果酸由于其結(jié)構(gòu)的相似性，幾乎在植物體中同時存在[2]，對其含量測定難度較大。本試驗首次在流動相中添加β-環(huán)糊精測定夏枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量，方法簡便、準確、重復(fù)性好。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A系列HPLC儀，包括在線真空脫氣裝置、二元梯度泵、自動進樣器、二極管陣列（PDA）檢測器和LC-Solution色譜工作站（日本島津公司）；FA1104N型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲醇為色譜純，水為娃哈哈飲用純凈水，其它試劑均為分析純；齊墩果酸對照品（批號:080921）、熊果酸對照品（批號:081019）均購自中國藥品生物制品檢定所；夏枯草購自安徽亳州，經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院李景華副教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取齊墩果酸和熊果酸對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，用乙醇溶解并定容，即得對照品貯備液，其質(zhì)量濃度均為0.5 mg·mL-1。精密量取齊墩果酸對照品貯備液1.0 mL和熊果酸對照品貯備液2.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，混勻并用甲醇定容，即得混合對照品溶液，其中齊墩果酸和熊果酸質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1 mg·mL-1。

2.2 供試品溶液的制備

稱取夏枯草樣品約200 g，用2 000 mL乙醇溶液回流提取，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮，得深綠色浸膏。將此浸膏加適量水后用正己烷萃取脫脂，再用二氯甲烷萃取。將二氯甲烷萃取部分濃縮蒸干，無水乙醇溶解后用5%NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH＝12，過濾，所得濾液用10%HCl溶液酸化至pH＝2.4，再加入1倍量pH＝2.4的蒸餾水，過濾，所得沉淀用蒸餾水洗至中性，60℃下真空干燥，得到三萜酸富集物。精密稱取此富集物0.005 1 g，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Tigerkin ODS3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:甲醇-10 mmol·L-1β-環(huán)糊精1%醋酸胺水溶液（86∶14）；流速:1.0 mL·min-1；檢測波長:210 nm；柱溫:40 ℃；進樣量:10 μL。齊墩果酸、熊果酸與雜質(zhì)峰的分離度均＞2.0；理論塔板數(shù)按齊墩果酸和熊果酸峰計算均＞6 000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10、15、20、30、40、50、60、80、100 μL，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，進樣量（X，μg）為橫坐標，制備標準曲線，得齊墩果酸的回歸方程為Y＝22 880X+30 405（r＝0.999 2），線性范圍為0.5～5.0 μg；熊果酸的回歸方程為Y＝42 541X+24 887（r＝0.999 8），線性范圍為1.0～10.0 μg。

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，同一濃度取5份，按上述色譜條件測定齊墩果酸和熊果酸色譜峰峰面積。結(jié)果，RSD分別為0.79%和1.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h測定齊墩果酸和熊果酸色譜峰峰面積。結(jié)果，RSD分別為2.2%和1.72%，表明供試品溶液中熊果酸和齊墩果酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取夏枯草初純物（批號:090821），按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定，按外標法計算含量。結(jié)果，樣品中齊墩果酸和熊果酸含量的RSD分別為0.95%和1.45%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號:090821）約2.5 g，共9份，分為3組，按低、中、高濃度分別加入齊墩果酸對照品0.022、0.027 5、0.033 mg和熊果酸對照品0.04、0.05、0.06 mg，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

分別精密吸取“2.1”、“2.2”項下的混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述方法測定樣品中齊墩果酸、熊果酸的峰面積，采用外標法計算含量，結(jié)果見表2。

3 討論

齊墩果酸和熊果酸均為五環(huán)三萜類成分，分子中僅存在1個雙鍵，通過PDA檢測器選取不同波長條件進行對比，發(fā)現(xiàn)其均在205 nm波長處有最大吸收，但在此波長下溶劑末端吸收較嚴重，基線不夠理想，故選擇210 nm作為檢測波長。

由于熊果酸和齊墩果酸的結(jié)構(gòu)極為相似，采用薄層掃描法[3]、毛細管區(qū)帶電泳-電化學(xué)檢測法[4]、衍生化氣相色譜法[5]和普通的RP-HPLC法[6～11]很難將其完全分離。目前以環(huán)糊精為代表的手性選擇劑被用于改進對映體的分離，流動相添加劑法不必事先將樣品制備成手性衍生物，而只需將手性選擇劑加入到流動相中，使手性選擇劑與樣品形成手性絡(luò)合物。雖然熊果酸和齊墩果酸不是手性對映體，但可以利用這2種五環(huán)三萜酸與環(huán)糊精衍生物形成的包合物的色譜行為不同而進行分離。試驗證明，在流動相中添加10 mmol·L-1β-環(huán)糊精可改善熊果酸與齊墩果酸色譜峰的峰形和分離度，從而提高檢測的靈敏度和準確度。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

在樣品制備過程中，為了得到更多的三萜類成分，本試驗對試樣提取后又經(jīng)萃取和消化過程再進行含量測定；同時又按常規(guī)的提取方法做了試樣，并以β-環(huán)糊精作流動相進行了檢測，分離度仍達到2.0以上。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:197.

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