柔性固定化木瓜蛋白酶的制備及在酶解波紋巴非蛤中的應(yīng)用

陳 忻，張俊敏，孫恢禮，杜健海，袁毅樺，陳智剛

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與化工系，廣東 佛山 528000；2.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；3.安安美容保健品有限公司，廣東 佛山 528000)

柔性固定化木瓜蛋白酶的制備及在酶解波紋巴非蛤中的應(yīng)用

陳 忻1，張俊敏1，孫恢禮2，杜健海1，袁毅樺1，陳智剛3

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與化工系，廣東 佛山 528000；2.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；3.安安美容保健品有限公司，廣東 佛山 528000)

在殼聚糖膜的表面接上分子鏈較長(zhǎng)的雙醛淀粉作為柔性固定化酶的載體，將木瓜蛋白酶固定在該載體上制成柔性固定化木瓜蛋白酶，并應(yīng)用于酶解波紋巴非蛤制備小分子肽。通過(guò)考察溫度、pH值、加酶量和固定化時(shí)間等條件對(duì)柔性固定化木瓜蛋白酶的酶活、酶活回收率的影響，確定最優(yōu)固定化條件。結(jié)果表明：雙醛淀粉用量0.8mg/g殼聚糖、柔性固定化酶溫度25℃、柔性固定化酶時(shí)間20h、加酶量40mg/g殼聚糖、pH8.0條件下所得的固定化酶酶活最高，酶活回收率63.35%。將該柔性固定化酶在酶解溫度40℃、pH7.0、加酶量1.0%、酶解時(shí)間4h條件下制備波紋巴非蛤小分子肽，產(chǎn)率為3.4055%。

殼聚糖；雙醛淀粉；固定化酶

綠色酶工程技術(shù)是開(kāi)發(fā)利用海洋生物蛋白資源的重要手段。蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶酶解后，其產(chǎn)物肽類具有分子質(zhì)量低，易被機(jī)體吸收、生物活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[1]。通過(guò)酶降解蛋白質(zhì)的途徑獲得具有各種生理功能的生物活性肽是目前最常見(jiàn)的方法，如能在海洋蛋白生產(chǎn)中選用固定化酶技術(shù)，就不僅能使酶的穩(wěn)定性有較大提高，固定化體系也適合于連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)，酶催化過(guò)程有利于控制，這為實(shí)現(xiàn)海洋生物活性肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了極大可能。波紋巴非蛤(Paphia undulata)是我國(guó)重要海洋貝類，浙江麂列島以南的整個(gè)沿海地區(qū)大量生產(chǎn)，波紋巴非蛤不但營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，而且還有很多保健功能，具有重要的食用和藥用價(jià)值，前期研究結(jié)果顯示，以木瓜蛋白酶為工具酶，酶解波紋巴非蛤可制備具有較強(qiáng)生物活性的小分子肽[2]。目前未見(jiàn)運(yùn)用固定化酶技術(shù)制備波紋巴非蛤小分子肽的報(bào)道[3]。

殼聚糖(Chitosan)屬多糖類，是一種生物相容性好、安全無(wú)毒、易獲得的天然高分子生物材料，易于進(jìn)行化學(xué)改性，引入新的功能團(tuán)，如可發(fā)生?；Ⅳ然?、醚化、醛亞胺化(Schiff反應(yīng))、N-烷基化、酯化、氧化、鹵化、接枝共聚等反應(yīng)，從而制得各種系列衍生物，也是一類性能優(yōu)良的固定化載體[4]。

本研究通過(guò)在殼聚糖(Chitosan)膜的表面接上分子鏈較長(zhǎng)的雙醛淀粉(dialdehyde starch，DAS)作為柔性固定化酶的載體，將木瓜蛋白酶固定在該載體上制成柔性固定化木瓜蛋白酶，并應(yīng)用于酶解波紋巴非蛤制備小分子肽。通過(guò)測(cè)定其柔性固定化酶活力和酶活回收率，確定最優(yōu)固定化條件，并測(cè)定酶解波紋巴非蛤軟體部分所得小分子肽的產(chǎn)率。旨在從分子水平去協(xié)調(diào)固定化材料表面結(jié)構(gòu)與酶蛋白構(gòu)效之間的關(guān)系，為海洋蛋白資源的產(chǎn)業(yè)化深度開(kāi)發(fā)進(jìn)行有益的探索。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

波紋巴非蛤，購(gòu)于佛山山紫市場(chǎng)，由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所孫恢禮研究員鑒定；殼聚糖(脫乙酰度95.53%) 浙江金殼生物化學(xué)有限公司；雙醛淀粉(AR級(jí))泰安市金山變性淀粉有限公司；冰乙酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等均為AR級(jí)；木瓜蛋白酶(生化試劑(BR)，實(shí)測(cè)酶活200萬(wàn)U/g)廣州威佳科技有限公司；半胱氨酸(生化試劑(BR)、干酪素(生化試劑(CP)) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸(L-Tyrosine) 加拿大Bio Basic Inc公司。

550-Series紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器 江蘇省金壇市宏華儀器廠；GOLDS54/ GOLDS53紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；SH2-D(2)循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；FA2004N電子分析天天平 上海精密儀器有限公司。

1.2 柔性固定化酶載體的制備

1.2.1 殼聚糖薄膜的制備

稱取2.5g的殼聚糖粉末，邊攪拌邊加入體積分?jǐn)?shù)8%乙酸至100mL，攪拌至完全溶解后可得到2.5g/100mL的殼聚糖乙酸液，將上述溶液量取15mL倒入直徑為12cm的培養(yǎng)皿中，水平放置，待完全干燥后加入20mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5% NaOH溶液浸泡4～5h，再將膜洗至中性。慢慢取出放在玻璃板上鋪平后用濾紙吸去表面水分，再自然風(fēng)干。將膜取出在50℃條件下干燥至質(zhì)量恒定，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 柔性載體的制備

取出上述殼聚糖薄膜2.50g，沿邊緣剪成寬4mm細(xì)絲，加入0.80g雙醛淀粉(DAS)及150mL 50%乙醇，于70℃條件下反應(yīng)24h后，冷卻至室溫，充分洗滌，置于pH8.00的Tris-HCl緩沖液中浸泡備用[4]。

1.2.3 柔性固定化載體的IR表征

取適量殼聚糖膜、Chitosan-DAS膜和DAS于50℃下干燥至質(zhì)量恒定，采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜分析。

1.3 柔性固定化木瓜蛋白酶的制備[4-6]

稱取2.50g柔性固定化載體加入到盛有150mL Tris-HCl緩沖溶液錐形瓶中，再加入30mg木瓜蛋白酶，在25℃條件下固定反應(yīng)20h后，用大量蒸餾水洗滌，再用Tris-HCl緩沖溶液洗滌，得到柔性固定化酶，將柔性固定化酶置于Tris-HCl(pH8.0)緩沖溶液備用。

1.4 木瓜蛋白酶活力的測(cè)定和計(jì)算

本實(shí)驗(yàn)中，木瓜蛋白酶的一個(gè)活力單位(U)相當(dāng)于單位時(shí)間內(nèi)釋放1μg的酪氨酸。游離酶活力、固定化酶活的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[7-9]。

式中：K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；V為酶活力測(cè)定液的總體積(包括酶液、酪蛋白、激活劑、終止劑)/mL；t為轉(zhuǎn)化底物時(shí)間(10min)；m1(V1)為固定化酶(或游離酶)活力測(cè)定用量；m2(V2)為固定化酶(或游離酶)總量，m的單位為g，V的單位為mL。

1.5 柔性固定化酶法制備波紋巴非蛤小分子肽

1.5.1 波紋巴非蛤酶解制備活性肽的工藝流程[3]

原料波紋巴非蛤→預(yù)處理→加水勻漿→用固體氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值→保溫酶解→冷卻→離心→加入磷鉬酸后過(guò)濾→波紋巴非蛤酶解清液

1.5.2 波紋巴非蛤小分子肽分離測(cè)定方法

采用隆丁區(qū)分法分離提取小分子肽[10-13]；酶解液中蛋白質(zhì)的測(cè)定采用半微量凱氏定氮法；酶解清液中游離氨基酸的測(cè)定采用甲醛滴定法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 柔性固定化載體的表征

殼聚糖膜、DAS、柔性固定化載體IR譜圖見(jiàn)圖1。

由圖1可知，柔性載體在1629cm-1出現(xiàn)了氨基與醛基反應(yīng)形成的希夫堿(Schiff base)的C=N吸收峰，因此判斷雙醛淀粉中的醛基與載體氨基結(jié)合形成了希夫堿。

圖1 殼聚糖膜、DAS、柔性固定化載體紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of chitosan, dialdehyde starch, flexible immobilization carrier

2.2 各因素對(duì)柔性固定化酶制備的影響

2.2.1 DAS用量對(duì)固定化酶活力回收率的影響

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在其他條件不變(固定化溫度2 0℃、pH8.0、固定化時(shí)間20h、加酶量30mg/g殼聚糖)，考察DAS用量對(duì)固定化酶活力、回收率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖2 DAS用量對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.2 Effect of DAS dosage on recovery rate of immobilized papain activity

從試驗(yàn)結(jié)果可知，DAS用量為0.8mg/g殼聚糖最適。當(dāng)DAS用量較少時(shí)，酶活回收率偏低，隨著DAS用量的增加，酶活回收率逐漸升高，當(dāng)DAS＞0.8mg/g殼聚糖，酶活回收率基本保持不變。這可能由于當(dāng)DAS的用量較少時(shí)，同一柔性鏈上的多個(gè)醛基同時(shí)和載體上的多個(gè)氨基發(fā)生多重反應(yīng)，這樣所得到的載體上只能結(jié)合少量的柔性鏈且柔性下降，致使酶活回收率偏低。而當(dāng)DAS的用量增加時(shí)，載體上可以結(jié)合更多的柔性鏈，致使載體的柔性及活性醛基量都增加，因此酶活回收率提高。但當(dāng)DAS用量進(jìn)一步增加時(shí)，因受到載體表面位阻的限制，DAS又是高分子物質(zhì)，其在載體表面的擔(dān)載量會(huì)達(dá)到一定的飽和度，被固定的酶量不再隨DAS的用量增加而增加，故酶活回收率趨于恒定。

2.2.2 固定化溫度對(duì)固定化酶活力回收率的影響

圖3 固定化溫度對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.3 Effect of immobilization temperature on recovery rate of immobilized papain activity

其他條件不變(pH8.0、固定化時(shí)間20h、DAS用量0.8mg/g殼聚糖、加酶量30mg/g殼聚糖)，考察固定化溫度對(duì)固定化酶活力及回收率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，固定化溫度為25℃最佳，當(dāng)固定化溫度較低或過(guò)高時(shí)，酶活回收率偏低，這是由于固定化溫度低時(shí)，載體上的醛基不活潑，不利于反應(yīng)進(jìn)行；而固定化溫度高時(shí)，由于游離酶的熱穩(wěn)定性較差，而且固定化的時(shí)間較長(zhǎng)，一部分的酶被固定于載體上之前已經(jīng)失活。

2.2.3 pH值對(duì)固定化酶活力回收率的影響

其他條件不變(DAS用量0.8mg/g殼聚糖、固定化溫度25℃、固定化時(shí)間20h、加酶量30mg/g殼聚糖)，考察pH值對(duì)固定化酶活、回收率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.4 Effect of pH on recovery rate of immobilized papain activity

試驗(yàn)結(jié)果表明固定化過(guò)程在pH值為8的偏堿性條件下效果最好。這是因?yàn)槊傅姆€(wěn)定性較差，當(dāng)pH值較高或較低時(shí)，一部分的酶被固定于載體上之前已經(jīng)失活，致使酶活回收率較低。

2.2.4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響

其他條件不變(DAS用量0.8mg/g殼聚糖、固定化溫度25℃、加酶量30mg/g殼聚糖、pH8.0)，考察固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力及回收率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活回收率先上升，而后下降。原因?yàn)椋涸谠囼?yàn)初期，酶不斷被固化，提高了酶活回收率。當(dāng)固定化時(shí)間超過(guò)20h后，一方面因

為載體表面所擔(dān)載的酶過(guò)量，造成位阻效應(yīng)，另一方面由于柔性固定化酶質(zhì)地較脆，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)容易碎裂。

圖5 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響Fig.5 Effect of immobilization time on recovery rate of immobilized papain activity

2.2.5 加酶量對(duì)酶活力回收率的影響

在其他條件不變(DAS用量0.8mg/g殼聚糖、固定化溫度25℃、pH8.0、固定化時(shí)間20h)，考察加酶量對(duì)固定化酶活力及回收率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖6 加酶量對(duì)酶活力回收率的影響Fig.6 Effect of enzyme addition amount on recovery rate of immobilized papain activity

如圖6所示，當(dāng)每1g載體所用酶量為40mg/g殼聚糖時(shí)，固定化酶的活力回收最多，繼續(xù)增加酶量，一方面因?yàn)殡p醛淀粉上醛基有限，另一方面由于酶越集中，空間位阻影響也就越大，而且底物與產(chǎn)物也來(lái)不及擴(kuò)散，所以酶的活力回收反而下降。

2.2.6 固定化酶的使用批次

選用Chitosan-DAS柔性載體，對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行柔性固定化，規(guī)定在37℃下60min轉(zhuǎn)化一定量酪蛋白液為1個(gè)使用批次，并考察此固定化酶的使用批次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 柔性固定化木瓜蛋白酶的使用批次Table1 Activity of flexible immobilized papain after several batches of uses

由表1可見(jiàn)，固定化酶使用6～7批次后仍保留有原固定化酶活力的一半左右。

2.3 柔性固定化酶制備波紋巴非蛤小分子肽試驗(yàn)結(jié)果

將該柔性固定化酶在酶解溫度40℃、pH7.0、柔性固定化酶加酶量質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、酶解時(shí)間4h條件下進(jìn)行酶解制備小分子肽，試驗(yàn)結(jié)果：濾液中蛋白質(zhì)含量為3.9375%，濾液中游離氨基酸含量為0.532%，波紋巴非蛤小分子肽產(chǎn)率為3.4055%，與前期研究結(jié)果[2]相比較，柔性固定化木瓜蛋白酶的優(yōu)點(diǎn)在于基本保持了酶的活性，經(jīng)回收可反復(fù)使用，提高了酶的利用效率，降低了生產(chǎn)成本。

3 結(jié) 論

以Chitosan-DAS為柔性載體，對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行柔性固定化，利用該柔性固定化酶進(jìn)行酶解波紋巴非蛤軟體部分制備小分子肽。結(jié)果顯示，柔性固定化酶溫度25℃、柔性固定化酶時(shí)間20h、加酶量40mg/g殼聚糖、pH8.0的柔性固定化條件下所得的固定化酶酶活最高，酶活回收率63.35%；利用柔性固定化木瓜蛋白酶酶解波紋巴非蛤制備小分子肽，產(chǎn)率為3.4055%。

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Preparation of Flexible Immobilized Papain

CHEN Xin1，ZHANG Jun-min1，SUN Hui-li2，DU Jian-hai1，YUAN Yi-hua1，CHEN Zhi-gang3
(1. Department of Chemistry and Chemical Engineering, Foshan University, Foshan 528000, China；2. South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China；3. Foshan Anan Beauty and Health Products Co. Ltd., Foshan 528000, China)

Long-chain dialdehyde starch was linked to the surface of chitosan membrane to obtain an immobilization carrier for enzyme. Flexible immobilized papain was prepared through fixing papain on the carrier and applied to prepare small molecule peptide by hydrolyzing aphia undulate. The optimal immobilization conditions were explored by evaluating the effect of immobilization temperature, pH, enzyme amount and immobilization time on enzyme activity and recovery rate of flexible immobilized papain. Results indicated that the optimal immobilization conditions were reaction temperature of 25 ℃, reaction time of 20 h, enzyme amount of 40 mg/g, and pH 8.0. Under the optimal immobilization conditions, the obtained immobilized papain exhibited the highest activity and the recovery rate of papain was 63.35%.

chitosan；dialdehyde starch；immobilized enzyme

Q556.3

B

1002-6630(2010)22-0500-04

2010-06-22

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAD94B08)；中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KZCX2-YW-209)；廣東省2009中國(guó)科學(xué)院-廣東省合作項(xiàng)目(00617381220824077)

陳忻(1968—)，女，副教授，碩士，主要從事生物材料及海洋化學(xué)研究。E-mail：fschenxin@tom.com