汾酒酒醅發(fā)酵過程中香氣成分的變化規(guī)律

曹云剛，胡永鋼，馬燕紅，杜小威，馬恩波，全哲學(xué)，張生萬,*

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032205；4.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433)

汾酒酒醅發(fā)酵過程中香氣成分的變化規(guī)律

曹云剛1，胡永鋼2，馬燕紅2，杜小威3，馬恩波1，全哲學(xué)4，張生萬1,*

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032205；4.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433)

采用氣相色譜(GC)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析方法，跟蹤考查汾酒發(fā)酵過程酒醅中各類香氣成分的動態(tài)變化規(guī)律及其相互關(guān)系。結(jié)果表明：酒醅中大多數(shù)香氣成分的含量在正常發(fā)酵期內(nèi)隨發(fā)酵進(jìn)行呈上升趨勢，發(fā)酵前期增長較快，發(fā)酵中后期增長趨于緩慢；但某些香氣成分的含量及量比關(guān)系與白酒產(chǎn)品相比卻存在一定的差異；汾酒夏季生產(chǎn)沒有必要延長發(fā)酵期，適當(dāng)縮短發(fā)酵時間可能更好。通過控制發(fā)酵條件或利用現(xiàn)代生物技術(shù)增乙降乳，進(jìn)一步探明白酒蒸餾機(jī)理改善蒸餾條件，是提高白酒質(zhì)量的重要措施。

清香型白酒；酒醅；香氣成分；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)；變化規(guī)律

汾酒是清香型白酒的典型代表，其清香純正、醇甜柔和、自然協(xié)調(diào)、余味爽凈的風(fēng)格使它在白酒中獨(dú)樹一幟，這主要是源于其微生物自然接種制曲，固態(tài)地缸發(fā)酵，甑桶蒸餾，陶壇儲存老熟的獨(dú)特生產(chǎn)工藝[1]。在汾酒發(fā)酵過程中，酒醅中的微生物區(qū)系此消彼長，各種物質(zhì)形態(tài)不斷地產(chǎn)生和消失，通過復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝變化，生成了多種香氣物質(zhì)，進(jìn)而形成了汾酒清雅純正的風(fēng)格特征。由于白酒中各種香氣成分的含量及其量比關(guān)系對白酒風(fēng)味的形成和風(fēng)格典型性起著至關(guān)重要的作用，因此近年來相關(guān)研究人員對白酒成分[2-8]，也取得了一定的成果。但對于清香型白酒發(fā)酵過程中香氣成分變化規(guī)律的研究，卻未見相關(guān)報(bào)道。

另外，傳統(tǒng)制曲工藝和發(fā)酵過程，缺乏科學(xué)理論依據(jù)，致使不同季節(jié)、不同生產(chǎn)批次的產(chǎn)品，微量香氣成分組成變化較大，產(chǎn)品質(zhì)量不夠穩(wěn)定，極大地制約了企業(yè)的快速發(fā)展，特別是在夏季高溫季節(jié)，不但

出酒率低且經(jīng)常引起酸敗致使企業(yè)停產(chǎn)，給企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國白酒行業(yè)中普遍存在乳酸乙酯含量過高的問題，給各類香型白酒的風(fēng)味及風(fēng)格典型性造成不可忽視的影響。本研究從汾酒發(fā)酵過程入手，采集不同發(fā)酵時期的酒醅，蒸餾提取代謝產(chǎn)物后，采用氣相色譜(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析[1,9-10]，考查汾酒發(fā)酵過程中各種香氣成分隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律，并進(jìn)行相關(guān)探討，旨在為白酒的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集山西杏花村汾酒廠夏季正常大茬發(fā)酵地缸中距離表層30cm處不同發(fā)酵時期的酒醅，冷凍保藏備用，采樣根據(jù)入缸發(fā)酵時間不同分別選取：0、3、5、7、9、11、15、21、28、40d；原漿汾酒 山西杏花村汾酒廠；3內(nèi)標(biāo)物(叔戊醇、乙酸正戊酯和α-乙基正丁酸)、甲醇、異戊醛(均為色譜純) 北京化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有Dean Switch裝置) 美國Agilent公司；GC-2010型氣相色譜儀 日本Shimadzu公司；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申科機(jī)械研究所；DF-101C型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3 酒醅中香氣成分的提取

分別稱取采集的各酒醅樣品50g置于250mL圓底燒瓶中，加飽和食鹽水100mL，常壓蒸餾，收集80～120℃范圍內(nèi)的餾分50mL，為酒醅香氣成分提取液，冷藏待測。

1.4 內(nèi)標(biāo)液及分析樣品的制備[1]

內(nèi)標(biāo)液的配制：分別精確稱取3種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(0.0213g叔戊醇、0.0203g乙酸正戊酯和0.0243g α-乙基正丁酸)置于盛有3mL無水乙醇的5mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻備用。

分析樣品的配制：準(zhǔn)確吸取10.00mL酒醅香氣成分提取液，置于10mL容量瓶中，精確加入0.1mL內(nèi)標(biāo)液，混勻，待進(jìn)樣分析。

1.5 分析條件及方法

1.5.1 GC分析條件及方法

色譜柱：澳大利亞SGE公司的BP-21FFAP柱(25m ×0.32mm，0.25μm)；程序升溫：初始溫度為45℃，保持4min，以3.5℃/min的速率升溫至230℃，保持20min；載氣為高純氮?dú)?純度為99.999%)；FID檢測器與汽化室溫度均為250℃；柱前壓為2.94×104Pa；進(jìn)樣量1μL；分流比為30:1。

1.5.2 GC-MS分析條件及方法

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV；離子源溫度250℃；傳輸線溫度280℃；四極桿溫度為150℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 29～400；數(shù)據(jù)采集速率為1.56Scans/s。第一根柱子為HP-FFAP(30m×0.25mm，0.25μm)，第二根柱子為Agilent HP-5(30m×0.25mm，0.25μm)。色譜條件：除色譜柱為HP-FFAP(30m× 0.25mm，0.25μm)、載氣為氦氣外，其他條件同1.5.1節(jié)GC分析條件及方法；Dean Switch切割時間為7.0～9.6min，將乙醇峰切入第二根柱子中。

2 結(jié)果與分析

2.1 汾酒中香氣成分定性分析

按1.5節(jié)分析條件及方法對原漿汾酒中香氣成分進(jìn)行GC-MS分析，其總離子流色譜圖如圖1所示。

表1 汾酒中香氣成分質(zhì)譜解析結(jié)果Table1 Aromatic components identified from the fermented grains during the fermentation process of Fen liquor

從圖1可以看出，在上述條件下共分離出75個組分。利用計(jì)算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫檢索與人工推測識譜相結(jié)合的方法，共確定了其中70個化合物的結(jié)構(gòu)，其結(jié)果如表1所示。

圖1 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of aromatic components from the fermented grains during the fermentation process of Fen liquor

2.2 酒醅中香氣成分隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律及其相互關(guān)系

對不同發(fā)酵時間采集的酒醅，按1.3節(jié)方法提取、1.4節(jié)方法配制成分析樣品后，采用內(nèi)標(biāo)定量法[1]按1.5.1節(jié)GC分析條件及方法跟蹤考查發(fā)酵過程中各類香氣成分的動態(tài)變化規(guī)律及其相互關(guān)系，其定量分析結(jié)果如表2所示。

2.2.1 酒醅中醇類香氣成分隨發(fā)酵時間的變化

表2分析結(jié)果顯示，所測定的多數(shù)醇類物質(zhì)變化規(guī)律基本一致，整體表現(xiàn)為發(fā)酵前期快速增長，發(fā)酵中期含量較為平穩(wěn)，在發(fā)酵后期及過發(fā)酵期(這里指28～40d這段發(fā)酵期，因?yàn)榉诰频膫鹘y(tǒng)工藝為發(fā)酵28d)有些醇類物質(zhì)含量又快速增長，而有些則有所下降。其中含量最高的乙醇在0～7d飛速增長，含量達(dá)到147.138mg/g，7～21d變化不大，21～40d又有較大幅度增長；異戊醇、異丁醇、甲醇、正丙醇以及2,3-丁二醇(左旋)的變化規(guī)律基本一致：在0～9d快速增長，此后含量較為平穩(wěn)；β-苯乙醇的含量在0～9d快速增長，9～15d較為穩(wěn)定，此后隨發(fā)酵進(jìn)行呈下降趨勢；糠醇在0～9d其含量快速增長至0.003mg/g，此后隨發(fā)酵的進(jìn)行呈逐漸下降趨勢。丁醇和戊醇的含量很低，在整個發(fā)酵過程中基本都低于0.001mg/g。

2.2.2 酒醅中醛類香氣成分隨發(fā)酵時間的變化

分析表2中醛類香氣成分的相關(guān)數(shù)據(jù)可知，乙醛的含量在入缸后0～5d內(nèi)隨發(fā)酵進(jìn)行快速上升，并在第5天達(dá)到0.0914mg/g，此后隨發(fā)酵進(jìn)行呈逐漸下降趨勢，這可能是由于隨發(fā)酵進(jìn)行，乙醇含量升高與乙醛形成乙縮醛的緣故。異丁醛的變化規(guī)律與乙醛基本一致，只是變化幅度較小?？啡┖捅郊兹┑淖兓厔荽篌w一致，隨發(fā)酵的進(jìn)行整體呈增長趨勢，發(fā)酵前期增長迅速，發(fā)酵中后期含量較為平穩(wěn)，過發(fā)酵期含量又略有增長。異戊醛含量很低，不易分析其變化規(guī)律。

2.2.3 酒醅中酸類香氣成分隨發(fā)酵時間的變化

從表2中酸類香氣成分的分析結(jié)果可以看出，乙酸在0～28d內(nèi)隨發(fā)酵進(jìn)行其含量整體呈快速增長趨勢，28～40d內(nèi)變化不大；丁酸和己酸的變化趨勢基本一致：7～9d快速增長，9～21d逐漸下降，21～40d又快速增長；戊酸在0～28d的變化趨勢與乙酸相似，但在第40天沒有檢出；苯甲酸和異戊酸的含量很低，在發(fā)酵前中期甚至無法檢出。

2.2.4 酒醅中酯類香氣成分隨發(fā)酵時間的變化

表2分析結(jié)果顯示，所測定的酯類物質(zhì)中，乳酸乙酯除在9～11d含量有所下降外，在其余發(fā)酵時間內(nèi)增長非常迅猛；乙酸乙酯在發(fā)酵前中期增長較快，發(fā)酵后期增長較為緩慢；甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、癸酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯以及硬脂酸乙酯隨發(fā)酵進(jìn)行其含量變化趨勢大體一致：發(fā)酵第一周增長較快，發(fā)酵第二周較為平穩(wěn)，其后隨發(fā)酵進(jìn)行又呈增長趨勢；高級脂肪酸乙酯，如油酸乙酯、亞油酸乙酯、9-烯-十六酸乙酯、11-烯-十六酸乙酯、9,12,15-三烯-十八酸乙酯等在發(fā)酵過程中都有檢出，它們的變化規(guī)律非常相似：從整體上看其含量隨發(fā)酵進(jìn)行呈增長趨勢，但期間呈馬鞍形波動，并表現(xiàn)出第5、9、15、28天含量較高的特點(diǎn)，在香氣成分提取過程中發(fā)現(xiàn)，這幾天的提取液混濁現(xiàn)象比較明顯，這主要是其中含有大量油酸乙酯和亞油酸乙酯等高級脂肪酸乙酯的緣故[11-12]；辛酸乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯和苯丙酸乙酯的含量很低，在發(fā)酵前期無法檢出；己酸乙酯在整個發(fā)酵過程中都幾乎無法檢出。

作為清香型白酒的特征香味物質(zhì)，乙酸乙酯和乳酸乙酯在酯類物質(zhì)中處于支配地位，其含量高低及比例關(guān)系很大程度上決定著清香型白酒的質(zhì)量及風(fēng)格。分析結(jié)果顯示酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量隨發(fā)酵進(jìn)行整體上呈增長趨勢，但分別在11～15、9～11d有所下降。這可能是因?yàn)榇藭r微生物大量增殖所需能源和碳源物質(zhì)需要不斷補(bǔ)充，而導(dǎo)致此時對于酯類的分解作用大于相應(yīng)的酯化作用。分析表2可知，乙酸與其對應(yīng)的乙酸乙酯在整個發(fā)酵過程中變化趨勢大體一致，但是乙酸在整個發(fā)酵過程中增長速度都很快，而乙酸乙酯在發(fā)酵前中期增長速度較快，發(fā)酵后期增長速度相對較慢。舒代蘭等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在濃香型白酒中乙酸與乙酸乙酯的生成趨勢大體一致。沈怡方認(rèn)為[14]，乙酸乙酯的形成有3條途徑：一是酵母菌在酒精發(fā)酵時的副產(chǎn)物；二是酒醅中多量乙酸經(jīng)微生物酯化而成；三是其他微生物發(fā)酵的代謝物。王月梅等研究認(rèn)為[15]，清香型白酒發(fā)酵中的酯化機(jī)理與濃香型、醬香型等白酒酯化有質(zhì)的差異，其乙酸乙酯主要是胞內(nèi)酶的代謝產(chǎn)物，與乙酸是否存在無關(guān)，酯化以前中期為主，后期酯化一說欠妥。本研究的結(jié)果顯示，汾酒中乙酸乙酯的生成以前中期為主，但也不能排除后期酯化的補(bǔ)償作用。乳酸乙酯的含量在11～40d又迅猛增長，這是因?yàn)榘l(fā)酵中后期為厭氧階段，微生物代謝反應(yīng)從以酯分解為主逐步過渡到以酯合成為主，且此時酒醅中積累的大量乳酸、乙醇使得乳酸乙酯大量而快速生成。沈怡方認(rèn)為[14]，在白酒生產(chǎn)中乳酸乙酯一是配醅帶入，二是發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生大量乳酸而形成。結(jié)合本研究可知，在汾酒大茬酒的生產(chǎn)中以第二條途徑為主。

表2 汾酒發(fā)酵酒醅中香氣成分的分析測定結(jié)果Table2 Change of aromatic components from the fermented grains during the fermentation process of Fen liquor mg/g

由于乳酸乙酯的含量在酒醅酯類香氣成分中占支配地位，故其隨發(fā)酵時間的變化趨勢與總酯含量的變化趨勢非常相似，如圖2所示。因此，可以通過對乳酸乙酯變化曲線的測定，大致預(yù)測酒醅中總酯的可能含量，對于判斷酒醅發(fā)酵是否正常具有一定的參考價值。

綜合分析汾酒發(fā)酵過程中各類香氣成分的變化規(guī)律可以發(fā)現(xiàn)，多數(shù)香氣成分隨發(fā)酵進(jìn)行其含量整體上呈增

長趨勢，發(fā)酵前期增長迅猛，發(fā)酵中后期含量較為平穩(wěn)，但在過發(fā)酵期某些成分大幅增長，而某些成分大幅減少。由于白酒的品質(zhì)取決于各種香味成分的含量及其量比關(guān)系，所以延長發(fā)酵時間雖然使得乙醇、總酯等含量有所增加，但卻破壞了它們之間的量比關(guān)系，從而降低了白酒的品質(zhì)。因此，對于汾酒傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝而言，在夏季沒必要延長發(fā)酵期。相反，從發(fā)酵過程中清香型白酒的主體香氣成分乙酸乙酯和乳酸乙酯各自的含量及其量比關(guān)系以及酸的變化趨勢等來看，汾酒夏季生產(chǎn)適當(dāng)縮短發(fā)酵時間可能更好。這與朱引保等[16]通過對生產(chǎn)實(shí)踐的總結(jié)分析所得結(jié)論基本一致。

另外，某些香氣成分在酒醅中的含量及量比關(guān)系與在白酒產(chǎn)品中存在一定的差異，尤其是作為清香型白酒特征香味物質(zhì)的乙酸乙酯和乳酸乙酯。在酒醅發(fā)酵中后期乳酸乙酯含量明顯大于乙酸乙酯，特別是在發(fā)酵后期，其含量約為乙酸乙酯的4～5倍，但在剛蒸出的基酒中，二者含量相當(dāng)，這很可能與白酒特殊的蒸餾過程及其“截頭去尾”的取酒方式[1,17-20]有關(guān)。由于乙酸乙酯的沸點(diǎn)較低，在酒頭中含量較高，而乳酸乙酯沸點(diǎn)較高，在酒尾中含量較高，因此，“截頭去尾”的取酒方式會打破它們原有的量比關(guān)系。目前普遍認(rèn)為，清香型白酒中乙酸乙酯含量要大于乳酸乙酯的含量，其比例一般在1.4:1～1.8:1較為適宜[4]，而我國白酒行業(yè)中目前普遍存在乳酸乙酯含量過高的問題。因此，通過控制發(fā)酵條件或利用現(xiàn)代生物技術(shù)[21-24]，提高酒醅中乙酸乙酯含量、降低乳酸乙酯含量，弄清白酒蒸餾機(jī)理并改善蒸餾條件，是提高白酒質(zhì)量的重要措施。

圖2 酒醅中總酯含量和乳酸乙酯含量隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律Fig.2 Variation of ethyl lactate and total esters in aromatic components from the fermented grains during the fermentation process of Fen liquor

3 結(jié) 論

3.1 酒醅中大多數(shù)香氣成分的含量在正常發(fā)酵期內(nèi)隨發(fā)酵進(jìn)行呈上升趨勢，發(fā)酵前期增長較快，發(fā)酵中后期增長趨于緩慢。

3.2 汾酒發(fā)酵酒醅中乳酸乙酯的含量除9～11d略有下降外，其余時間隨發(fā)酵進(jìn)行快速增長；乙酸乙酯的生成以發(fā)酵前中期為主，但也不能排除后期酯化的補(bǔ)償作用。3.3酒醅中乳酸乙酯與乙酸乙酯的量比與在白酒產(chǎn)品中相比有較大差異。這很可能與白酒特殊的蒸餾過程及其“截頭去尾”的取酒方式有關(guān)。

3.4 汾酒夏季生產(chǎn)沒有必要延長發(fā)酵期，適當(dāng)縮短發(fā)酵時間可能更好。

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Variation of Aromatic Components in Solid Phase Fermented Grains During Fermentation of Fen Liquor

CAO Yun-gang1，HU Yong-gang2，MA Yan-hong2，DU Xiao-wei3，MA En-bo1，QUAN Zhe-xue4，ZHANG Sheng-wan1,*
(1. School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；3. Shanxi Xinghuacun Fen Wine Factory Co. Ltd., Fenyang 032205, China；4. School of Life Science, Fudan University, Shanghai 200433, China)

The dynamic change of the aromatic components in the solid phase fermented grains during different fermentation stage of Fen liquor was studied by using GC and GC-MS, and the relationship among alcohols, aldehydes, acids and esters was investigated. The results show that: (1) The contents of major aroma components in fermented grains displayed an upward trend in the fermentation process, which grew rapidly in the earlier fermentation stage but became slow in the middle-later period. However, the absolute contents and relative ratios of some aroma components in fermented grains are different from those in the final liquor product. (2) The fermentation time of Fen liquor in summer need not to be prolonged, and it is supposed to be better if being properly shortened. (3) The key to improve the quality of liquor production is to increase ethyl acetate while decrease ethyl lactate, to clarify the liquor distillation mechanism and to improve the distillation conditions.

Fen-flavor liquor；fermented grains；aroma components；gas chromatography-mass spectrometry(GCMS)；dynamic change

TS262.3

A

1002-6630(2010)22-0367-05

2010-01-21

山西省回國留學(xué)人員科研項(xiàng)目(200902)；山西省科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2007101016)

曹云剛(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：200823104001@mail.sxu.cn

*通信作者：張生萬(1955—)，男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)、藥物合成。E-mail：zswan@sxu.edu.cn