熒光分光光度計測定保健食品總抗氧化能力

趙 建，劉 璇，文 鏡*

(北京聯(lián)合大學 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191)

熒光分光光度計測定保健食品總抗氧化能力

趙 建，劉 璇，文 鏡*

(北京聯(lián)合大學 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191)

目的：建立用熒光分光光度計測定總抗氧化能力的方法。方法：以2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為過氧自由基來源，sodium fluorescein(FL)為熒光指示劑，水溶性VE(trolox)為定量標準，熒光值半數(shù)衰減時間作為觀察指標，測定6種保健食品的總抗氧化能力。結(jié)果：方法的最低檢測限為0.22μmol/L，線性回歸方程Y= 25.432X+2.0625，R2=0.9949，平行性精密度(RSD)3.5%，重復性精密度(RSD)3.9%，加標回收率在90%～104%之間。結(jié)論：用熒光分光光度計可以測定保健食品總抗氧化能力。

食品檢測；總抗氧化能力；熒光分光光度法

生物活性物質(zhì)總抗氧化能力是物質(zhì)清除不同自由基或物質(zhì)的不同活性成分清除不同自由基的有效和，鑒于抗氧化活性物質(zhì)在機體內(nèi)起作用的正是其總的抗氧化能力，因此可用總抗氧化能力(total antioxidant activity，TAA)來評價生物活性物質(zhì)的抗氧化功能[1-5]。

氧自由基吸收能力法(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)是近年來由Cao等[6-7]在Glazer[8]研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種總抗氧化能力測定方法。它是基于H原子轉(zhuǎn)移機制(HAT)的一種方法，其與生理相關(guān)性高于基于電子轉(zhuǎn)移(SET)機制的方法[9]，可以通過改變自由基和反應體系的溶劑，測定脂溶性和水溶性物質(zhì)的抗氧化活性[10-14]。實驗以2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為過氧自由基來源，其與抗氧化劑的摩爾比非常高，使得方法專一性強[15-16]。方法中使用的熒光素(FL)不與待測樣品發(fā)生作用，不會干擾樣品的測定結(jié)果，因此對抗氧化劑測定具有特異性。

ORAC法使用自動熒光酶標儀作為測定儀器，由于該機器價格昂貴，限制了該方法的普及。與之相比，熒光分光光度計價格低廉、應用廣泛，因此有必要研究用熒光分光光度測定天然產(chǎn)物及保健食品總抗氧化能力的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂益康粉、蟲草粉、紅曲粉、山竹粉、茄紅素營養(yǎng)膠囊、景天養(yǎng)身膠囊均購于同仁堂藥店。

熒光素(FL)、VE水溶性類似物(trolox) Acros公司；2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH) 美國J&K Chemica公司；VC、環(huán)己烷、二甲亞砜、三水磷酸氫二鉀、二水磷酸二氫鈉(以上試劑均為分析純) 北京化工廠；去離子水。

1.2 儀器與設備

RF-5301 PC熒光分光光度計 日本島津公司；TDL-5-A型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；BF211D電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州南北儀器設備有限公司；移液器德國艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 ORAC法原理

使用FL為氧化底物，AAPH為自由基產(chǎn)生劑。FL在有自由基作用下被氧化，熒光強度逐漸減弱；當有抗氧化劑存在時，熒光強度減弱被抑制，且抗氧化劑對FL熒光強度的保護能力與其濃度呈正比。以抗氧化劑Trolox作為標準，用來定量樣品的抗氧化能力。

1.3.2 檢測波長的選擇

分別移取FL使用液0.3mL和75mmol/L磷酸鹽緩沖液2.7mL，置于一潔凈干燥試管中，充分混合后用熒光分光光度計掃描吸收和發(fā)射光譜圖，確定最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長。

1.3.3 AAPH用量選擇及在系統(tǒng)中釋放過氧自由基穩(wěn)定性觀察

用量選擇：AAPH不穩(wěn)定，易受pH值、溫度等因素的影響，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，每次開展新實驗前，要重新確定其最佳用量，確定原則為FL熒光值半數(shù)衰減時間在5～15min為宜。

AAPH釋放過氧自由基的穩(wěn)定性觀察：在相對恒溫的環(huán)境下，用熒光半數(shù)衰減時間指標對AAPH釋放過氧自由基的穩(wěn)定性進行觀察。

1.3.4 標準曲線繪制及方法可靠性分析

1.3.4.1 標準曲線繪制

取Trolox儲備液(終濃度10μmol/L)加磷酸鹽緩沖液依次稀釋成濃度5.000、2.500、1.250、0.625、0.312、0.156μmol/L五個Trolox標準溶液。另設一支自由基對照(+AAPH)管、一只空白對照(-AAPH)管。各管分別加入終濃度63nmol/L FL使用液0.3mL，標準管加入75 mmol/mL磷酸鹽緩沖液0.3mL，五個濃度的Trolox 0.3mL，(+AAPH)管、(-AAPH)管分別加入75mmol/mL磷酸鹽緩沖液0.6mL和2.7mL，混勻，除(-AAPH)管外，其他各管分別加入終濃度4mmol/L AAPH 2.1mL，充分混勻，并開始計時。以熒光半數(shù)衰減時間作為縱坐標、Trolox濃度為橫坐標繪制標準曲線。熒光半數(shù)衰減時間的記錄方法：以(-AAPH)管的熒光值為一個單位，當熒光值降低到0.5個單位時所用的時間即熒光半數(shù)衰減時間。

1.3.4.2 最低檢測限下限

連續(xù)測定空白(+AAPH)熒光半數(shù)衰減時間8次，最低檢測限=3s/K。式中，s為標準偏差；K為標準曲線斜率。

1.3.4.3 平行性精密度實驗

準確稱取0.01g山竹粉5份，分別測定總抗氧化能力并計算ORAC值及RSD值。具體方法如下：0.01g山竹粉加入3mL環(huán)己烷和3mL 75mmol/L磷酸鹽緩沖液，充分振蕩10min，再4000r/min離心10min，然后靜置使其自然分層。移出并保留上層環(huán)己烷提取液，再以同樣方法提取一次。合并兩次環(huán)己烷提取液，用于脂溶性成分總抗氧化能力測定；合并兩次水溶性提取液，用于水溶性總抗氧化能力測定。環(huán)己烷提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸至快干時，用氮氣吹干。用2mL二甲亞砜溶解，并用磷酸緩沖液適當稀釋后用于樣品脂溶部分抗氧化能力的測定。測定方法操作參照1.3.4.1節(jié)，注意溶劑對照管中要加入等量的二甲亞砜，代替(+AAPH)管。結(jié)果ORAC值以μmol Trolox/g樣品表達。水提取液，直接(或用75mmol/L磷酸鹽緩沖液適當稀釋后)用于樣品水溶部分抗氧化能力的測定。樣品脂溶與水溶成分總抗氧化能力相加即為樣品的總抗氧化能力。

1.3.4.4 重復性精密度實驗

山竹樣品連續(xù)測定5d，方法同1.3.4.3節(jié)。記錄熒光半數(shù)衰減時間，計算ORAC值及RSD。

1.3.4.5 加標回收率實驗

準確稱取0.01g山竹粉2份，其中1份定量加入0.00250g Trolox(即10μmol Trolox)。按1.3.4.3節(jié)方法平行操作。重復實驗5次，計算加標回收率。

1.3.5 樣品總抗氧化能力檢測

操作方法同1.3.4.3節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長

設定激發(fā)波長為485nm，掃描發(fā)射波長，最大發(fā)射光譜峰在512nm(圖1)。設定發(fā)射波長為512nm，掃描激發(fā)波長，最大激發(fā)光譜峰在491nm(圖2)。因此，確定最佳激發(fā)、發(fā)射波長分別為491nm和512nm。

圖1 FL發(fā)射光譜圖Fig.1 Emission spectrum of sodium fluorescein

圖2 FL激發(fā)光譜圖Fig.2 Excitation spectrum of sodium fluorescein

2.2 試劑用量與AAPH在系統(tǒng)中釋放過氧自由基穩(wěn)定性觀察

FL熒光值在AAPH作用下衰減速度不宜過快。過快，樣品的熒光半數(shù)衰減時間不容易拉開，靈敏度會降低。但也不宜過慢而導致實驗時間增加。經(jīng)反復測試，在本實驗室條件下，AAPH溶液終濃度4mmol/L時FL熒光衰減速度適宜。

AAPH釋放過氧自由基的速度具有一定的波動性，由圖3可知，在試劑配制4h以后，熒光半數(shù)衰減時間出現(xiàn)上升趨勢，說明過氧自由基釋放速度有所減緩。

圖3 AAPH釋放過氧自由基隨時間變化的影響Fig.3 Change of peroxy free radical release from AAPH as the time change

2.3 標準曲線及方法可靠性分析

2.3.1 Trolox標準曲線制作

實驗結(jié)果表明，熒光半數(shù)衰減時間與Trolox濃度有良好線性關(guān)系，線性方程為Y=25.43X＋2.062，線性相關(guān)系數(shù)為0.9949(圖4)。

圖4 Trolox標準曲線Fig.4 Standard curve of Trolox

2.3.2 方法可靠性分析

2.3.2.1 最低檢測下限

表1 最低檢測限測定結(jié)果Table1 The minimum detection limit of the established method

表1結(jié)果表明，該方法最低檢測限為0.22μmol/L。通過幾種保健食品的總抗氧化能力測定，其數(shù)值在102～103μmol/g，所以此方法完全可以滿足測定需要。

2.3.2.2 平行性精密度實驗

表2 平行性實驗結(jié)果Table2 Results of parallel experiments

表2結(jié)果表明，方法平行性精密度為3.5%，說明該方法的平行精密度良好，測定結(jié)果較滿意。

2.3.2.3 重復性精密度實驗

表3結(jié)果表明，方法重復性精密度為3.9%，說明

該方法的重復性良好，測定條件易控制，測定結(jié)果較滿意。

表3 重復性實驗結(jié)果Table3 Results of repeatability experiments

2.3.2.4 加標回收率實驗

表4 加標回收率實驗結(jié)果Table4 Results of recovery experiments with spiked samples

表4結(jié)果表明，加標回收率范圍為90%～104%，與熒光酶標儀測定總抗氧化能力的加標回收率相差不大[11]，回收率結(jié)果比較好，說明本測量方法的誤差較小，可以作為本實驗的測定方法。

2.4 測定保健品總抗氧化能力

綜合考慮保健食品脂溶性部分和水溶性部分抗氧化能力，作為保健食品的總抗氧化能力。6種保健食品均準確稱取0.01g。為了保證在工作曲線內(nèi)測定，用75mmol/L磷酸鹽緩沖液對提取液進行不同倍數(shù)的稀釋。測定結(jié)果見表5。

表5 保健食品總抗氧化能力Table5 Total antioxidant capacity of health food

表5結(jié)果表明，紅曲、山竹、景天養(yǎng)身水溶部分抗氧化能力優(yōu)于脂溶部分；蕃紅素、蟲草、脂益康脂溶部分抗氧化能力優(yōu)于水溶部分。

3 討 論

ORAC法是基于HAT機制的方法，與經(jīng)典的脂質(zhì)過氧化的方法類似，最接近生理真實的氧化過程。因此，ORAC法應用在保健食品抗氧化能力檢測具有重要意義，它既可以直接檢測保健食品的總抗氧化能力，其中脂溶性和水溶性兩部分抗氧化能力可以分別評價；也可以測定攝入保健食品前后動物血液或臟器總抗氧化能力，并根據(jù)其變化情況，進行兩者相關(guān)性研究，為保健食品的研發(fā)提供重要依據(jù)。

ORAC法在我國開展的并不普遍，主要原因是受到了儀器設備的限制。本實驗用熒光分光光度計替代全自動熒光酶標儀，用熒光半數(shù)衰減時間替代熒光衰退曲線下面積，建立了新的實驗方法。首先確定了熒光分光光度計的最佳激發(fā)、發(fā)射波長分別為491nm和512nm。由于ORAC法是由FL、AAPH和抗氧化劑(樣品或標準Trolox)組成的一個三元結(jié)構(gòu)的實驗體系。FL的熒光非常穩(wěn)定，AAPH產(chǎn)生的過氧自由基能夠使FL氧化導致熒光衰退，抗氧化劑捕捉自由基保護FL不被氧化，同時其不與FL反應，不會影響FL的熒光值，因此實驗標準曲線線性的好壞以及方法可靠性的關(guān)鍵在于AAPH釋放過氧自由基的穩(wěn)定性。實驗發(fā)現(xiàn)，AAPH釋放過氧自由基具有一定的波動性，試劑放置4h以上，自由基釋放速度有下降趨勢。因此，在測定樣品同時要帶一個標準和空白(+AAPH)。

用熒光分光光度計測定熒光衰退曲線下面積費時費力。測定一個樣品需要間隔2min測一個數(shù)據(jù)，連續(xù)測定120min。如果能用熒光半數(shù)衰減時間替代熒光衰退曲線下面積，則只需要測定2個數(shù)據(jù)，時間約為40min。從圖4可以看到熒光半數(shù)衰減時間與Trolox濃度有良好線性關(guān)系，線性方程為Y=25.43X+2.062，線性相關(guān)系數(shù)為0.9949。本實驗在研究中用熒光衰退曲線下面積為觀察指標進行測定，其與Trolox濃度的線性方程為Y= 26.03X－0.2578，線性相關(guān)系數(shù)為0.9941。說明完全可以用熒光半數(shù)衰減時間替代熒光衰退曲線下面積作為抗氧化能力的觀察指標。

標準曲線及方法可靠性分析顯示：方法的最低檢測限為0.22μmol/L、線性回歸方程Y=25.43X+2.062，R2= 0.9949、平行性精密度RSD=3.5%、重復性精密度RSD為3.9%、加標回收率在90%～104%之間，說明用熒光分光光度計可以測定保健食品總抗氧化能力。

[1]朱玉昌, 焦必寧. ABTS 法體外測定果蔬類總抗氧化能力的研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(8): 77-78.

[2]徐清萍, 鐘桂芳, 孟君. 抗氧化劑抗氧化方法研究進展[J]. 食品工程, 2007, 2(6): 23-25.

[3]BENZIE I F F, STRAIN J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power : the FRAP assay[J]. Anal B ioche, 1996, 239: 70-76.

[4]MILLERN J, DIP LOCK A T, RICE E C, et al. A. A novelmethod for

measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates[J]. Clin Sci, 1993, 84: 407-412.

[5]BRANDW W, CUVELIERM E, BERSET C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J]. Lebensm Wiss Technol, 1995, 28(1): 25-30.

[6]CAO G, ALESSIO H M, CUTLER R G. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidangts[J]. Free Radic Biol Med, 1993, 14: 303-311.

[7]CAO G, PRIOR R L. Comparison of the analyticalmethods for assessing the total antioxidant capacity of human serum[J]. Clin Chem, 1998, 44(6): 1309-1315.

[8]GLAZER A N. Phycoerythrin flouorescence-based assay for reactive oxygen species[J]. Meth Enzymol, 1990, 186: 161-168.

[9]李華, 李佩洪, 王曉宇, 等. 抗氧化檢測方法的相關(guān)性研究[J]. 食品與生物技術(shù)學報, 2008, 27(4): 6-11.

[10]OU Boxin, HAMPSCH-WOODILL M, FLANAGAN J, et al. Novel fluorometric assay for hydroxyl radical prevention capacity using fluorescein as the probe[J]. J Agric food chem, 2002, 50(10): 2772-2777.

[11]OU Boxin, HAMPSCH-WOODILL M, PRIOR R L. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe[J]. J Agric Food Chem, 2001, 49: 4619-4626.

[12]續(xù)潔琨, 姚新生, 栗原博. 抗氧化能力指數(shù)(ORAC)測定原理及應用[J]. 中國藥理學通報, 2006, 22(8): 1015-1021.

[13]PFITZNER I, FRANCZ P I, BIESALSKI H K. Carotenoid: methylbeta-cyclodextrin formulations: an improved method for supp-lamentation of cultured cells[J]. BBA Gen Subjects, 2000, 1474: 163-168.

[14]PRIOR R L, HOANG H, GU L, et al. Assays for hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity [oxygen radical absorbance capacity (ORAC FL)] of plasma and other biological and food samp les[J]. J Agric Food Chem , 2003, 51(11): 3273 - 3279.

[15]王會, 郭立, 謝文磊. 抗氧化劑抗氧化活性的測定方法[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(3): 98-102.

[16]劉小兵. 生物活性物質(zhì)的抗氧化能力評價方法及其研究進展[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2008, 20(5): 440-444.

Total Antioxidant Capacity Determination of Health Food by Fluorescence Spectrophotometer

ZHAO Jian，LIU Xuan，WEN Jing*
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To establish a determination method of total antioxidant capacity by fluorescence spectrophotometer. Methods: Total antioxidant capacity of health food were determined by a fluorescence method using AAPH as the source of peroxy free radicals, sodium fluorescein (FL) as the fluorescent indicator, water-soluble vitamin E (Trolox) as the quantitative standard and half fluorescence decay time as the observation index. Results: This established method had the detection limit of 0.22 μmol/L, linear regression equation of Y = 25.432X + 2.0625 with a coefficient constant of 0.9949, parallel precision of 3.5% and repeatability precision of 3.9%. The recovery rates of spiked samples were in the range of 90%－104% through the determination of six health food samples. Conclusion: Fluorescence spectrophotometer can be used for total antioxidant capacity of health food.

food test；total antioxidant capacity；fluorescence spectrophotoscopy

TS207.3

A

1002-6630(2010)22-0301-05

2010-03-09

北京市教委科技發(fā)展計劃項目(KM201011417006)

趙建(1972—)，男，工程師，學士，主要從事保健食品功能評價研究。E-mail：zhaojian@ygi.edu.cn

*通信作者：文鏡(1952—)，男，教授，學士，主要從事保健食品功能學評價機理和方法學研究。E-mail：wenjing@ygi.edu.cn