酶解斑點叉尾鮰內(nèi)臟制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制產(chǎn)物

楊曉軍，陸劍鋒*，林 琳，段瑞霞，翁世兵，葉應旺，姜紹通

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

酶解斑點叉尾鮰內(nèi)臟制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制產(chǎn)物

楊曉軍，陸劍鋒*，林 琳，段瑞霞，翁世兵，葉應旺，姜紹通

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

以斑點叉尾鮰內(nèi)臟為原料，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率為指標，篩選出木瓜蛋白酶為酶解的最適蛋白酶，并研究該酶的酶解時間、酶添加量、初始pH值、酶解溫度、液料比(mL/g)對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響，通過正交試驗優(yōu)化得到了具有ACE抑制活性的酶解產(chǎn)物的最佳工藝條件。結果表明：最優(yōu)酶解條件為初始pH7.5、酶解溫度55℃、液料比2:1(mL/g)，酶解產(chǎn)物ACE抑制率為72.34%。

斑點叉尾鮰；魚內(nèi)臟；抑制率；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；木瓜蛋白酶

在中國，高血壓患病人數(shù)多達1.2億，每年死于心血管疾病的人數(shù)達200萬，其主要為高血壓患者[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE)在人體腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，對血壓調(diào)節(jié)起著重要作用，ACE催化水解血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變成具有血管收縮作用的血管緊張素Ⅱ，同時使舒緩激肽失活，引起血壓升高[2-3]。常規(guī)的降血壓藥作用時間短，停藥后會產(chǎn)生血壓反跳，并有損害腎功能和引起低血壓、干咳等副作用[4]。在以天然、健康為主題的今天，人們越來越傾向于預防保健和食療，來源于食品的降血壓肽具有巨大的潛在市場[5]。

目前，我國淡水魚產(chǎn)量在不斷提高，規(guī)?；牡a(chǎn)品加工業(yè)也逐漸發(fā)展起來，但大部分加工企業(yè)只對魚肉部分進行利用(生產(chǎn)魚片、魚糜和魚糜制品等)，對加工產(chǎn)生的下腳料的利用卻很少。在這些下腳料中，魚內(nèi)臟占有很大的比例[6]。斑點叉尾鮰(I c t a l u r u s punctatus)屬于一種經(jīng)濟價值較高的大型淡水魚，主要用于生產(chǎn)鮰魚片，而在加工過程中產(chǎn)生的大量下腳料，包括魚排、內(nèi)臟、魚皮、邊角料等，一直未得到有效的綜合利用[7]。魚內(nèi)臟中的蛋白含量較為豐富，通過生物酶解技術，可酶切成為能被動物直接吸收及利用的短肽和氨基酸，利用這種產(chǎn)量大、質(zhì)量低的加工下腳料，既開拓了新的蛋白資源，又解決了環(huán)境問題[8]。此外，以低值淡水魚廢棄物為原料制得的魚降壓肽不僅具

有魚蛋白的優(yōu)點，同時還具有良好的酸、熱穩(wěn)定性、溶解性以及獨特的降血壓功能，比魚蛋白和它的氨基酸更易消化吸收[9]。因此，本實驗以斑點叉尾鮰內(nèi)臟為原料，ACE抑制率為指標，對ACE抑制產(chǎn)物的酶解制備技術進行了初步研究，可為今后低值淡水魚廢棄物的綜合利用提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑點叉尾鮰魚內(nèi)臟 安徽省明光市永言水產(chǎn)(集團)有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL) Sigma化學公司；胃蛋白酶(≥1200U/g) 國藥集團化學試劑有限公司；木瓜蛋白酶(80萬U/g生物酶制劑)、堿性蛋白酶(≥5萬U/g)、中性蛋白酶(20萬U/g)、復合動物蛋白水解酶(生物酶制劑)、復合風味蛋白酶(生物酶制劑) 南寧龐博生物工程有限公司；硼酸、乙酸乙酯等均為分析純。

1.2 儀器與設備

DK-20超級循環(huán)水浴磁力攪拌器 金壇市文化儀器有限公司；HH-2孔數(shù)顯水浴鍋 江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠；CT15RT冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；TGL-16H離心 珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；DHG-9123J精密恒溫鼓風干燥箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司；SP-752紫外吸光光度計 上海光譜儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯酸度計 上海天達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料基本組分的測定

水分含量測定方法參照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》；蛋白質(zhì)含量測定方法參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》；灰分測定方法參照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》；脂肪含量測定方法參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》。

1.3.2 斑點叉尾鮰內(nèi)臟的酶解流程

解凍后的斑點叉尾鮰內(nèi)臟經(jīng)人工去除大塊的魚油，用絞肉機攪碎成糜狀。按照實驗需要稱取適量魚內(nèi)臟于250mL的具塞三角瓶中→調(diào)節(jié)料液比→調(diào)節(jié)pH值→預熱→加酶，在設定的溫度和時間下反應→沸水中加熱10min，結束反應→離心→抽濾→取上清液測定抑制活性。

1.3.3 ACE 抑制活性的測定

ACE抑制活性的測定方法參照Cushman等[10]的方法，并稍作改進。在2mL Eppendorf管中依次加入100μL 6.0mmol/L Hip-His-Leu 溶液和40μL 的斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解產(chǎn)物(預先將酶解產(chǎn)物的pH值調(diào)至8.3)，并混合均勻，于37℃保溫4min后，再加入20μL ACE溶液(溶解于含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸鹽緩沖液中，pH8.3，活力0.05U/mL)，混勻后在37℃水浴保溫30min，之后加入250μL 1.0mol/L鹽酸溶液以終止反應，加入1.5mL乙酸乙酯，經(jīng)15s 振蕩混勻后，4000r/min 離心10min，用移液槍吸取1.0mL上層的乙酸乙酯，在110℃烘箱中烘30min，用3mL雙蒸水重新溶解，經(jīng)旋渦混合器混和15s后，在228nm處測定其吸光度。

式中：A為ACE及ACE抑制產(chǎn)物都參與反應的條件下228nm處測得的吸光度；B為ACE 抑制產(chǎn)物不參與反應的條件下228nm處測得的吸光度；C為ACE不參與反應的條件下228nm處測得的吸光度。

ACE和HHL溶液的配制方法參照[11]，并稍作修改。ACE溶液的配制：將0.25U的ACE溶于5mL 0.1mol/L 的硼酸緩沖液(pH8.3，含0.3mol/L NaCl)中即得，分裝后在－20℃低溫保存；HHL溶液的配制：取HHL適量，以0.1mol/L的硼酸緩沖液(pH8.3，含0.3mol/L NaCl)溶解配成6.0mmol/L HHL溶液，分裝后在－20℃低溫保存。

1.3.4 斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解工藝的優(yōu)化

在不同蛋白酶的最適酶解條件(溫度、pH值)下進行試驗(表1)，并做空白對照實驗，篩選得到酶解魚內(nèi)臟制備ACE抑制產(chǎn)物的最適酶，并研究該酶的酶添加量、酶解時間、酶解溫度、初始pH值、料液比等因素對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，選擇對ACE抑制率有顯著影響的因素，用正交試驗方法進行優(yōu)化。

表1 不同蛋白酶水解條件Table1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

1.3.5 水解度與抑制活性的關系

參加反應氮量(總氮)的測定采用GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)測定》；游離氨基氮測定采用甲醛滴定法[12]。

在正交試驗優(yōu)化得到的最佳酶解工藝條件下進行試驗，研究酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制活性的關系。

2 結果與分析

2.1 原料基本組分含量

表2 斑點叉尾鮰內(nèi)臟的基本組分Table2 Basic compositions of the viscera from I. punctatus

從表2可以看出，斑點叉尾鮰內(nèi)臟蛋白質(zhì)含量較高，達到11.90%，可以作為蛋白質(zhì)源進行后續(xù)的酶解實驗。由于原料經(jīng)絞肉機攪碎前已經(jīng)去除了部分魚油，所以內(nèi)臟脂肪的含量相對較低[7]。

2.2 確定制備ACE抑制產(chǎn)物的最佳酶解條件

2.2.1 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE抑制率

圖1 不同蛋白酶對斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解液ACE抑制活性的影響Fig.1 Effects of different proteases on ACE inhibition activity of viscera hydrolysates from I. punctatus

從圖1可以看出，由木瓜蛋白酶制備得到的斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性最高，抑制率值為58.84%。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的酶解產(chǎn)物ACE抑制率差異顯著。未添加蛋白酶組的酶解產(chǎn)物也具有ACE抑制活性，可能是由于斑點叉尾鮰內(nèi)臟中含有內(nèi)源性蛋白酶，它同樣也能夠酶解內(nèi)臟生成具有ACE抑制活性的產(chǎn)物(如短肽)[13]，然而由于內(nèi)臟中的內(nèi)源性蛋白酶含量較低，且種類較多，酶解條件復雜，故酶解得到的產(chǎn)物ACE抑制活性也相對較低。

2.2.2 木瓜蛋白酶添加量對酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響

從圖2可以看出，隨著木瓜蛋白酶添加量的增大，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，抑制活性達到最大值時，酶添加量2%。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，當酶添加量較少時，酶不能完全與底物結合，產(chǎn)生具有ACE抑制活性的產(chǎn)物較少；之后酶添加量逐漸增大，酶將生成的具有ACE抑制活性的產(chǎn)物降解成相對分子質(zhì)量更加小的產(chǎn)物，故造成ACE抑制活性下降。

圖2 酶添加量對斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of enzyme addition amount on ACE inhibition activity of viscera hydrolysate from I. punctatus

2.2.3 酶解時間對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

圖3 酶解時間對斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on ACE inhibition activity of viscera hydrolysate from I. punctatus

從圖3可以看出，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性隨酶解時間的延長，呈現(xiàn)先增大后趨于緩和的趨勢。當酶解時間少于3h時，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性隨酶解時間的增大而升高，并且趨勢比較明顯。當酶解時間達到3h后，再增加酶解時間，產(chǎn)物ACE抑制活性升高趨勢不明顯(酶解反應已經(jīng)徹底完成)。由于反應時間越長，對能源的消耗就越大，故選擇3h為最佳酶解時間。

2.2.4 酶解溫度對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

圖4 酶解溫度對斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on ACE inhibition activity of viscera hydrolysate from I. punctatus

從圖4可以看出，木瓜蛋白酶酶解魚內(nèi)臟制備ACE抑制產(chǎn)物的最適酶解溫度為55℃左右。當溫度小于55℃時，隨著酶解溫度的增大，酶促反應速率加快，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性也逐步增大；然而當酶解溫度過于增大時，蛋白酶在高溫下將變性失活，導致酶促反應速率反而下降[14]，因此溫度高也不利于酶解產(chǎn)物的生產(chǎn)或活性保持。故選擇55℃為最佳酶解溫度。

2.2.5 酶解體系初始pH值對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

圖5 酶解體系初始pH值對斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on ACE inhibition activity of viscera hydrolysate from I. punctatus

從圖5可以看出，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性隨酶解體系初始pH值的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。木瓜蛋白酶有其最適底物pH值，當?shù)孜飌H值低于或高于最適pH值時，活性均較低，產(chǎn)生的ACE抑制產(chǎn)物較少，即ACE抑制活性低于或高于最適底物pH值時，其產(chǎn)物ACE抑制活性也相對較低。故選擇pH7.5為木瓜蛋白酶的最適底物pH值。

2.2.6 液料比對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響

圖6 液料比對斑點叉尾鮰內(nèi)臟酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響Fig.6 Effect of liquid-material ratio on ACE inhibition activity of viscera hydrolysate from I. punctatus

從圖6可以看出，隨著酶解體系液料比的增大，產(chǎn)物ACE抑制活性出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當液料比較小時，酶解體系比較黏稠，使酶和底物結合的幾率降低，導致產(chǎn)物ACE抑制活性較低。當液料比較大時，反應底物和木瓜蛋白酶的結合濃度相對降低，反而不利于酶解反應的快速進行[15]。故選擇液料比為2:1。

2.2.7 正交試驗優(yōu)化

通過試驗篩選得出木瓜蛋白酶為酶解斑點叉尾鮰內(nèi)臟制備ACE抑制產(chǎn)物的最適蛋白酶，根據(jù)單因素試驗結果及相關資料，選擇酶解體系初始pH值、酶解溫度、液料比3個因素，以酶解產(chǎn)物ACE抑制率為指標，進行三因素三水平正交試驗，因素水平如表3所示，試驗結果見表4。

表3 正交試驗因素水平表Table3 Factors and levels of orthogonal experiments

表4 正交試驗結果與分析Table4 Results and analysis of orthogonal experiments

從表4可以看出，酶解體系初始pH值對酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響最大，初始pH值為7.5時酶解產(chǎn)物ACE抑制活性最高；酶解溫度次之，酶解溫度55℃時，產(chǎn)物活性最高；液料比影響最小，液料比為2:1時，產(chǎn)物活性最高。最終確定酶解試驗的最佳組合為A2B2C2，即初始pH7.5、酶解溫度55℃、液料比2:1。對正交優(yōu)化的酶解工藝條件進行驗證實驗，得到酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為72.85%，對比正交表中的結果(試驗2)，表明本試驗方案的優(yōu)化過程有效且重現(xiàn)性好。

2.3 酶解產(chǎn)物ACE抑制率與水解度關系

從圖7可以看出，酶解產(chǎn)物ACE抑制活性與水解度沒有明顯的線性關系。當酶解時間為1h時，酶解產(chǎn)物的水解度已經(jīng)基本上接近最大值，隨著酶解時間的增大，水解度緩慢升高。酶解產(chǎn)物ACE抑制活性在酶解時間3h時達到最高，之后隨酶解時間增大，ACE抑制

活性呈現(xiàn)下降的趨勢，表明并不是酶解產(chǎn)物水解度越大，ACE抑制活性越高[16]。在一定的酶解時間范圍內(nèi)，隨著酶解產(chǎn)物水解度的增大，ACE抑制活性逐步升高，表明酶解產(chǎn)生各種具有ACE抑制活性的產(chǎn)物逐漸增多。然而隨著酶解時間的延長，部分具有ACE抑制活性的產(chǎn)物被酶解成更加短的產(chǎn)物，從而失去ACE抑制活性，這與姚成虎等[11]的研究結果相符。

圖7 酶解產(chǎn)物水解度與ACE抑制率的關系Fig.7 Relationship between hydrolysis degree and ACE inhibition rate of hydrolysate

3 結 論

通過對木瓜蛋白酶水解斑點叉尾鮰內(nèi)臟蛋白的單因素及正交試驗，得到水解的最佳工藝條件，結果表明在木瓜蛋白酶水解內(nèi)臟的酶添加量2%、初始pH7.5、液料比2:1、溫度55℃、時間3h時，酶解產(chǎn)物對ACE的抑制活性最大，抑制率為72.34%。驗證實驗表明優(yōu)化出的最佳酶解工藝具有較好的可重現(xiàn)性。但酶解不同的原料或采用不同的蛋白酶，得到的酶解產(chǎn)物活性高低可能會不一樣，如 Boye等[17]采用胰蛋白酶酶解扁豆蛋白，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率大于90%，因此今后還可以嘗試使用復合酶解的工藝方法來制備活性更高的ACE抑制產(chǎn)物。此外，酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率之間沒有明顯的線性關系。

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Enzymatic Preparation of Angiotensin Ⅰ-converting Enzyme (ACE) Inhibitory Products Derived from Viscera of Channel Catfish

YANG Xiao-jun，LU Jian-feng*，LIN Lin，DUAN Rui-xia，WENG Shi-bing，YE Ying-wang，JIANG Shao-tong
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In this study, viscera of channel catfish, Ictalurus punctatus, were used as the raw materials to prepare angiotensinⅠ-converting enzyme (ACE) inhibitory products on the basis of its inhibitory rate of ACE. Papain was identified as the optimal enzyme. The effects of enzymatic hydrolysis time, enzyme addition amount, initial pH, hydrolysis temperature, and liquidmaterial ratio on the inhibitory rate of prepared ACE inhibitory products were investigated by orthogonal experiments. Results indicated that the optimal enzymatic hydrolysis conditions were initial pH of 7.5, hydrolysis temperature of 60 ℃, and liquidmaterial ratio of 2:1. Under the optimal conditions, the ACE inhibitory rate of enzymatic hydrolysate reached up to 72.34%.

Ictalurus punctatus；fish viscera；inhibitory rate；angiotensinⅠ-converting enzyme；papain

TS254.9

A

1002-6630(2010)22-0237-05

2010-06-22

安徽省“十一五”重大科技攻關專項(08010301078)；科技部“星火計劃”項目(2008GA710021)

楊曉軍(1984—)，男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏研究。E-mail：yang1_2_3@163.com

*通信作者：陸劍鋒(1976—)，男，副研究員，博士，主要從事水生動物資源的保護和綜合利用研究。E-mail：lujf@sibs.ac.cn