大粒車前子多糖提取工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)測定

林慧霞，聶少平*，殷軍藝，李 菁，李 昌，謝明勇

(南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

大粒車前子多糖提取工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)測定

林慧霞，聶少平*，殷軍藝，李 菁，李 昌，謝明勇

(南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

采用水提、醇沉法從大粒車前子中提取得到多糖提取物，然后經(jīng)Sevag法脫蛋白、SephacrylTMS-400 HR葡聚糖凝膠柱層析分離純化，得到PLCP-1、PLCP-2和PLCP-3三個組分。應用高效凝膠滲透色譜法等方法測定PLCP-2組分純度及其理化性質(zhì)；進一步采用單因素試驗結(jié)合二次響應面法對車前子多糖提取工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明：PLCP-2為均一多糖(PLP)，測得其相對分子質(zhì)量為1849268、糖含量87.3%、蛋白含量1.2%、糖醛酸含量14.7%；通過嶺脊分析獲得最佳提取工藝條件，結(jié)合實際操作將最佳條件修正為提取溫度99℃、料液比1:30(g/mL)、提取時間5.45h，實際測得多糖得率為13.79%，與理論預測值比較接近。該工藝經(jīng)濟、簡約、可行性強。

車前子多糖；分離純化；理化性質(zhì)；二次響應面法

車前子為大粒車前(Plantago asiatica L.)或平車前(Plantag depressa Willd.)的干燥成熟種子[1]，車前子被我國衛(wèi)生部列為可用于保健食品的物質(zhì)，也是我國傳統(tǒng)中醫(yī)用藥之一。性甘，微寒，歸肝、腎、肺、小經(jīng)，具有清熱利尿、滲濕通淋、明目祛痰的功能[2]。車前子種皮外表細胞壁含有的黏液質(zhì)，是一種親水性膠體，也是車前子中主要的有效成分，常被稱為車前子多糖，據(jù)研究車前子多糖是一種部分發(fā)酵性膳食纖維，不僅具有整腸通便作用，還有降低血脂、調(diào)節(jié)血糖的功能[3]。

車前子中多糖主要是極性的大分子，水溶性較好，所以一般采用水提法包括冷水浸提法、溫水浸提法、沸

水浸提法、稀堿提取法等。近年來，超聲波提取法[3]、超臨界流體萃取法等[4]等也逐漸應用到多糖提取工藝中。為了增加多糖得率，有學者對原料進行碾松外皮或粉碎[5-6]，或以單一或復合酶、微波、超聲等進行輔助提取[3]。車前子多糖是一種比較特殊的多糖，黏性比較大，這給多糖的分離純化帶來較大的困難，本實驗室曾采用AKTA系統(tǒng)成功地從大粒車前子中分離、純化得到均一多糖，并發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[7]。本研究采用常規(guī)凝膠柱層析進行多糖分離純化，以期能獲得不同分離體系下的多糖組分以用于結(jié)構(gòu)和活性研究測試，對其提取工藝優(yōu)化作探討，并對各項理化指標進行測定，為大粒車前子多糖的實際應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大粒車前子產(chǎn)自江西吉安，自然曬干。

SephacrylTMS-400 HR葡聚糖凝膠填料 Amersham Biosciences公司；D-木糖 上海國藥試劑公司；考馬斯亮藍G-250(進口分裝) Fluka公司；牛血清蛋白Amersco公司；硫酸、無水乙醇、氯仿、正丁醇、咔唑等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPHA1-2型冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；AL 104型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器公司；DHL-A型電腦恒流泵 上海青浦滬西儀器廠；TDL-5型離心沉淀機 上海飛鴿系列離心機廠；Milli-Q型超純水儀 美國Millipore公司；高效液相色譜儀 Waters公司；Nicolet FT-IR 5700型傅里葉紅外光譜儀 Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 車前子精制多糖的制備

稱取已過20目篩的車前子50g，加80%乙醇400mL浸泡1d，雙層濾布過濾，濾渣置于50℃烘箱中揮干乙醇。干燥后，加500mL蒸餾水，沸水浴回流提取3h，4800r/min離心分離10min，雙層濾布過濾，濾渣重復提取一次，合并濾液，真空濃縮，木瓜蛋白酶酶解2h，再用Sevag法(氯仿-正丁醇體積比為4:1)反復脫蛋白，然后用流動自來水透析48h，蒸餾水透析24h，透析液真空濃縮后緩慢加入9 5%食用級乙醇(終體積分數(shù)為80%)，于4℃冰箱中醇沉過夜，4800r/min離心分離10min，濾渣依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗兩次，冷凍干燥得車前子精制多糖(Plantago asiatica L. crude polysaccharide，PLCP)，備用。

1.3.2 車前子多糖的純化

采用SephacrylTMS-400 HR(2.4cm×60cm)葡聚糖凝膠柱層析對PLCP進行分離純化，苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖，繪制洗脫曲線。流動相：0.15mol/L NaCl溶液；流速：1.25mL/min，4mL/管。

1.3.3 純度及平均相對分子質(zhì)量測定

配制1mg/mL的葡萄糖、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70和藍色葡聚糖溶液。

色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTMLinear Column (7.8cm×300mm)；流動相為超純水，流速為0.6mL/min；檢測器為示差檢測器；柱溫為35℃；進樣量為20μL。

1.3.4 基本理化性質(zhì)測定

以一定物質(zhì)的量比的單糖混合溶液為標準，作得標準曲線，苯酚-硫酸法測定總糖含量[8]。以牛血清蛋白為標準，作得標準曲線，考馬斯亮藍法[9]測蛋白含量。以葡萄糖醛酸為標準，作得標準曲線，硫酸-咔唑法[10]測定糖醛酸含量。

1.3.5 紫外-可見光譜分析

采用200～900nm波長范圍對樣品進行光譜掃描。

1.3.6 車前子多糖提取工藝優(yōu)化

以80%乙醇浸泡24h后的干燥車前子為原料，熱水浸提，離心過濾得到澄清液，測得粗多糖含量再作多糖提取率換算，以其作為指標(車前子多糖相對于木糖的換算因子K=1.45，粗多糖得率/%=(提取物多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100)，對影響多糖提取率的3個主要因素：料液比、提取溫度和提取時間進行單因素分析。然后依據(jù)響應面分析軟件SAS 8.0提供的模型設(shè)計三因素三水平試驗，并確定3因素零水平和波動區(qū)。設(shè)料液比、提取溫度、提取時間3因素為自變量，粗多糖得率為響應值。響應面試驗因素與水平取值見表1。

表1 車前子多糖提取響應面試驗因素與水平編碼Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of polysaccharides from the seeds of Plantago asiatica L.

2 結(jié)果與分析

2.1 車前子多糖純化洗脫曲線

葡聚糖凝膠柱層析是根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同進行分離。PLCP經(jīng)SephacrylTMS-400 HR柱層析分離后得到PLCP-1、PLCP-2和PLCP-3三個組分(圖1)；單

批次收集樣品經(jīng)高效凝膠滲透色譜(HPGPC)檢測發(fā)現(xiàn)PLCP-2為單一對稱峰，富集后檢測其純度仍然很高，記為PLP。

圖1 PLCP洗脫曲線Fig.1 Elution profile of PLCP on gel permeation chromatography

2.2 純度及平均相對分子質(zhì)量測定的重均分子質(zhì)量(Mw)約為1600000D；付志紅等[14]采用Sepharose 6(10mm×300mm)凝膠柱層析純化大粒車前子多糖得一均一組分，推測分子質(zhì)量為891000D；本實驗得出的車前子多糖分子質(zhì)量為1849268D。這說明不同的車前子品種、不同的提取、分離純化的手段得到的車前子多糖相對分子質(zhì)量不盡相同。

表2 葡聚糖系列的保留時間和分配系數(shù)Table2 Retention time (tR) and partition coefficient (Kav) of Dextran series

圖2 PLP的示差色譜圖Fig.2 Differential chromatogram of PLP

2.3 基本理化性質(zhì)測定

表3 PLP化學組成分析Table3 Chemical compositions of PLP

取制備好的供試品溶液20μL，按1.3.3節(jié)色譜條件進樣，結(jié)果見圖2。圖2中均為均勻?qū)ΨQ單一峰，由此可知經(jīng)葡聚糖凝膠系統(tǒng)純化后所得多糖PLP為均一多糖。

采用UltrahydrogelTMLinear 凝膠柱，以葡聚糖系列(T-10、T-40、T-70和藍色葡聚糖)為標準，以葡萄糖測定凝膠柱外水體積，表2中列出了葡聚糖系列在流動相為水時測得的保留時間tR和分配系數(shù)Kav。采用分配系數(shù)Kav[Kav=(Ve－V0)/(Vt－V0)，其中V0為藍色葡聚糖的洗脫體積，Vt為葡萄糖的洗脫體積，Ve為測定葡聚糖或樣品的體積，洗脫體積為保留時間與流速的乘積]對葡聚糖標準的lgMW值進行回歸處理，得標準曲線Kav=－0.2426lg Mw+1.6297，R=0.9727。PLP的保留時間為8.233min(圖2)，從該標準曲線上可求得大粒車前子多糖PLP平均相對分子質(zhì)量為1849268。

Tomada等[11]從大粒車前子中分離的“Plantago mucilage A”，推測其分子質(zhì)量約1500000D；Al-Assaf等[12]測得卵葉車前子殼水提及堿提液分子質(zhì)量為7000000D左右，提取的車前子膠分子質(zhì)量為1000000～2000000D；王東等[13]采用純化大粒車前子多糖組分PPA

對于均一多糖，可以直接以其組成單糖作標準，建立回歸方程。但對于車前子多糖由不同殘基組成的雜多糖，不同單糖的標準曲線的斜率不同，所以應當采用與雜多糖的單糖組成摩爾比相同的混合單糖作標準建立回歸方程，求得其總糖含量[15]。由于車前子多糖中阿拉伯糖和木糖占絕大多數(shù)，因此本實驗中選用與樣品單糖組成相同的阿拉伯糖和木糖混合溶液作標準求出總糖含量。檢測結(jié)果表明PLP中的糖含量較高，達87.3%?？捡R斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量很少為1.2%。

以葡萄糖醛酸為標準，硫酸-咔唑法測糖醛酸含量，據(jù)文獻報道[11,13,16]，大粒車前子多糖中主要的糖醛酸為葡萄糖醛酸，本實驗采用硫酸-咔唑法以葡萄糖醛酸為標準對照物測得車前子多糖PLP組分中的糖醛酸含量為14.7%。但此法受樣品中的中性單糖的干擾，且不能測定樣品中糖醛酸的種類，因而也存在誤差。本實驗所得結(jié)果與王東等[13]純化的車前子多糖PPA中糖醛酸含量11.9%比較接近。

2.4 車前子多糖提取單因素試驗

2.4.1 料液比對多糖提取率的影響

平行稱取5份5g的干燥車前子，固定其他提取因素，料液比分別取1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(g/ mL)，結(jié)果如圖3所示，在設(shè)定范圍多糖得率總體呈上升趨勢。料液比在1:30～1:50之間，粗多糖得率變化不

明顯。由于料液比過大會給后續(xù)操作帶來不便，最終確定料液比為1:30。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.4.2 溫度對多糖提取率的影響

圖4 溫度對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

平行稱取5份5g干燥車前子，料液比1:30，提取時間5h，提取溫度分別為30、50、70、90、100℃。結(jié)果如圖4所示，溫度對多糖得率影響很大，在50～90℃間多糖得率顯著增大，90℃之后緩慢上升，綜合考慮，提取溫度確定為9 0℃。

2.4.3 提取時間對多糖提取率的影響

圖5 提取時間對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

平行稱取5份5g干燥車前子，料液比1:30，提取溫度為90℃，設(shè)定提取時間為1、3、5、7、9h，結(jié)果如圖5所示，提取時間對多糖得率影響顯著，從1h到5h多糖得率顯著增大，在5h后，隨著時間延長，多糖得率小幅度下降，但總體趨于穩(wěn)定，因此就單因素而言，提取時間取5 h為宜。

2.4.4 響應面分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理[17]，設(shè)計了三因素三水平共15個點的響應面分析試驗，用統(tǒng)計軟件SAS對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。

表4 響應面分析試驗結(jié)果Table4 Results of response surface experiments

以粗多糖提取率作為響應值，根據(jù)表4中實驗數(shù)據(jù)，用SAS軟件多元回歸分析，所得分析結(jié)果見表5、6。經(jīng)回歸擬合，得到如下多元二次響應面回歸模型：

表5 響應面分析試驗結(jié)果Table5 Result analysis of response surface experiments

表6是二次響應面回歸模型方差分析表。此模型P＜0.0002，響應面回歸模型達到高顯著水平，決定系數(shù)為0.9887，說明回歸方程擬合成程度很好。由3個因素影響的車前子多糖提取率變異系數(shù)為98.87%。逐項顯著

性檢驗結(jié)果表明，方程一次項、二次項影響都是顯著的，交互項作用影響不顯著，各具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關(guān)系。殘差部分均由隨機誤差引起，不存在模型擬合不足的現(xiàn)象，二次曲面能真實地擬合響應面。

表6 回歸方程方差分析Table6 Variance analysis of the established regression equation

表7 因素方差分析表Table7 Variance analysis of each factor

從表7可以看出，影響車前子多糖得率各因素按影響大小排序為提取溫度＞提取時間＞料液比。其中提取溫度對車前子多糖提取率影響達到了極顯著水平(P＜0.001)，而料液比對車前子多糖提取率影響不顯著(P＞0.05)。

圖6 料液比(X1)和提取溫度(X2)與多糖提取率(Y)的響應面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between material-liquid ratio and extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.

圖7 料液比(X1)提取時間(X3)與多糖提取率(Y)的響應面圖Fig.7 Response surface plot for the effect of cross-interaction between material-liquid ratio and extraction time on extraction rate of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.

圖8 提取溫度(X2)和提取時間(X3)多糖提取率(Y)的響應面圖Fig.8 Response surface plot for the effect of cross-interaction between extraction temperature and extraction time on extraction rate of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.

從圖6可知，提取溫度要比料液比對車前子多糖提取率影響大；從圖7可知，提取時間要比料液比對車前子多糖提取率影響大；從圖8可知，提取溫度要比提取時間對車前子多糖提取率影響大。

表8 嶺脊分析表Table8 Ridge analysis table

表8是嶺脊分析結(jié)果，從表8中可以得出，最大響應值時的編碼半徑為1，此時提取溫度為98.91℃，料液比為1:30.2，提取時間為5.45h。

為檢驗二次響應面法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行多糖的浸提實驗，實際測得多糖得率為13.79%，與理論預測值比較接近。因此，采用此法得到的提取優(yōu)化條件參數(shù)準確可靠，有一定實用價值。

3 討 論

本研究采用葡聚糖凝膠常壓柱層析柱法從大粒車前子精制多糖中分離純化得到均一組分PLP。HPGPC法測得PLP的相對分子質(zhì)量為1849268。基本理化性質(zhì)測定結(jié)果表明，PLP是含有少量蛋白的酸性多糖，而且糖含

量較高，達到87.3%。而PLP的結(jié)構(gòu)表征及相應構(gòu)效關(guān)系，仍有待于進一步研究。結(jié)合單因素試驗，采用響應面分析、嶺脊分析和RSA法探索車前子多糖最優(yōu)提取條件：提取溫度98.91℃、料液比1:30.2、提取時間5.45h、結(jié)合實際操作，將最佳條件修正為提取溫度99℃、料液比1:30、提取時間5.45h，實際測得多糖得率為13.79%，與理論預測值比較接近。

[1]衛(wèi)生部藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 一部[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1990: 49.

[2]鄭虎占. 中國現(xiàn)代研究與應用: 第二卷[M]. 北京: 學苑出版社, 1997: 100.

[3]付志紅, 謝明勇, 聶少平. 微波技術(shù)用于車前子多糖的提取[J]. 食品科學, 2005, 26(3): 151-154.

[4]廖周坤, 姜繼祖, 王化遠. 超臨界CO2萃取藏藥雪靈芝中總皂苷及多糖研究[J]. 中草藥, 1998, 29(9): 601.

[5]張振秋, 孫兆姝, 袁昌魯, 等. 車前子中車前子膠提取工藝研究[J].遼寧中醫(yī)雜志, 1997, 24(1): 39-40.

[6]陳潔輝, 劉奮強, 林紹光, 等. 車前子水提條件的探討及沖劑的制備[J]. 中草藥, 1999, 30(1): 16-18.

[7]黃丹菲, 聶少平, 唐永康, 等. 大粒車前子中苯乙醇苷類化合物對樹突狀細胞的調(diào)控研究[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(14): 1831-1834.

[8]周超, 謝明勇, 萬茵, 等. 車前子多糖的測定方法研究[J]. 分析實驗室, 2008, 27(4): 10-13.

[9]王多寧, 趙雁武, 田芙蓉. 考馬斯亮藍微盤比色法測定蛋白質(zhì)含量[J]. 第四軍醫(yī)大學學報, 2001, 22(6): 528-529.

[10]林穎, 黃琳娟, 田庚元. 一種改良的糖醛酸含量測定方法[J]. 中草藥, 1999, 30(11): 817-819.

[11]TOMODA M, YOKOI M, ISHKAWA K. Plant mucilages. XXIX. Isolation and characterization of a mucous polysaccharide, Plantago-mucilage A , from the seeds of Plantago major. asiatica[J]. Chem Pharm Bull, 1981, 29(10): 2877-2884.

[12]AL-ASSAF S, PHILLIPS G O, WILLIAMS P A, et al. Molecular weight, tertiary structure, water binding and colon behaviour of ispaghula husk fibre[J]. Proc Nutr Soc, 2003, 62(1): 211-216.

[13]王東, 袁昌魯, 楊雅寧, 等. 車前子多糖的研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2008, 35(6): 909-910.

[14]付志紅, 謝明勇, 聶少平, 等. 不同品種車前子中多糖含量比較[J].中國中藥雜志, 2004, 29(6): 581-582.

[15]陳海華, 許時嬰. 亞麻籽膠中多糖含量的測定[J]. 糧油加工與食品機械, 2003(10): 116-117.

[16]SAMUELSEN A B, LUND I, DJAHROMI J M, et al. Structural features and anti-complementary activity of some heteroxylan polysaccharide fractions from the seeds of Plantago major L.[J]. Carbohydrate Polymers, 1999, 38(2): 133-143.

[17]BOX G P, BEHNKEN D W. Some new three level design for the study of quantitative variables[J]. Teehnometries, 1960(2): 456-475.

Extraction Processing and Physico-chemical Properties of Polysaccharides from Seeds of Plantago asiatica L.

LIN Hui-xia，NIE Shao-ping*，YIN Jun-yi，LI Jing，LI Chang，XIE Ming-yong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Polysaccharides were isolated from seeds of Plantago asiatica L. by water extraction and ethanol precipitation, and then subjected to protein removal by Sevag method and purification using gel permeation chromatography on SephacrylTMS-400HR column. Extraction conditions were optimized by orthogonal design and response surface methodology on the basis of extraction rate of polysaccharides. Three fractions were obtained and named as PLCP-1, PLCP-2 and PLCP-3. Results showed that PLCP-2 (also named as PLP) was a kind of homogeneous polysaccharides with molecular weight of 1849268 Da determined by high performance gel permeation chromatography. The contents of polysaccharides and protein were 87.32% and 1.16%, respectively; while the content of uronic acid was 14.66%. The optimal extraction conditions were extraction temperature of 99℃, material-liquid ratio of 1:30 (g/mL) and extraction time of 5.45 h. Under these optimal extraction conditions, the extraction rate of polysaccharides from Plantago asiatica L. was 13.79%, which was in agreement with the predicted value. This optimal extraction conditions are economic, simple and feasible, and also provide a theoretical reference for industrial preparation of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L..

Plantago asiatica L.；purification；physico-chemical properties；response surface methodology

TQ929.2

A

1002-6630(2010)22-0226-06

2010-06-17

國家自然科學基金項目(20802032)；教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目(200804030001)；江西省自然科學基金項目(2008GZH 0050)；食品科學與技術(shù)國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200806)

林慧霞(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品化學與食品分析。E-mail：lin1986310@163.com

*通信作者：聶少平(1978—)，男，副教授，博士，研究方向為食品科學與工程、食品營養(yǎng)與安全及糖生物學。E-mail：spnie@ncu.edu.cn