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    夏枯草總黃酮的提取分離與自由基清除活性研究

    2010-03-23 02:04:51熊雙麗李安林
    食品科學(xué) 2010年22期
    關(guān)鍵詞:黃酮質(zhì)量

    熊雙麗,李安林

    (西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽 621010)

    夏枯草總黃酮的提取分離與自由基清除活性研究

    熊雙麗,李安林

    (西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽 621010)

    分析超聲波輔助提取對夏枯草總黃酮得率的影響,采用正交設(shè)計試驗優(yōu)化總黃酮提取工藝,篩選適合于分離總黃酮的大孔吸附樹脂,最后研究其自由基清除活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):超聲波輔助提取不能提高夏枯草總黃酮得率,最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:30(g/mL)、時間3h、溫度80℃,得率可達(dá)5.05%;大孔吸附樹脂AB-8適合于分離夏枯草總黃酮;紫外-可見光譜分析其可能為黃烷酮和雙氫黃酮醇類;隨質(zhì)量濃度增加,夏枯草總黃酮的DPPH自由基和羥自由基清除活性越接近VC,當(dāng)質(zhì)量濃度分別大于82μg/mL和0.83mg/mL時,兩者的清除率都大于90%,顯著高于叔丁基羥基茴香醚。

    夏枯草;黃酮;自由基;分離純化

    抗氧化劑不僅能防止食品氧化,提高保鮮效果,還有許多預(yù)防和保健功能。由于合成抗氧化劑如BHT和BHA的安全性問題,以及人們對健康食品的要求,開發(fā)安全性的高活性天然抗氧化劑已成為當(dāng)前迫切的研究課題[1-3]。夏枯草(Prunella vulgaris Linn)主要含有三萜、甾醇、黃酮類、香豆素及糖類等,具有降壓、抗病毒、及抗腫瘤等多種藥理作用[4-6],為進一步了解其化學(xué)成分與生物活性之間的關(guān)系和控制其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),對其多糖、三萜類化合物及香豆素研究甚多,而關(guān)于黃酮類化合物的提取分離及生物活性研究還處于相當(dāng)滯后的狀態(tài),廖麗等[7]發(fā)現(xiàn)不同居群夏枯草總黃酮含量變異幅度2.16%~10.29%。袁萍等[8]認(rèn)為非極性大孔吸附樹脂D-101適合用于夏枯草總黃酮的分離純化。杜輝等[9]卻發(fā)現(xiàn)弱極性大孔吸附樹脂AB-8適合于夏枯草總黃酮的分離。本實驗首先分析超聲波輔助提取對夏枯草總黃酮得率的影響,再采用正交設(shè)計試驗優(yōu)化夏枯草總黃酮提取工藝,再篩選適合于分離夏枯草總黃酮的大孔吸附樹脂,最后研究其對DPPH自由基和羥自由基清除活性,為夏枯草總黃酮的構(gòu)效關(guān)系及應(yīng)用研究提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    夏枯草 涪江中藥飲片廠。蘆丁對照品 南京替斯艾么中藥研究所;DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基)、叔丁基羥基茴香醚(BHA) Sigma公司;D-101、AB-8、X-5、DA-201 天津海光化工有限公司;乙醇、硝酸鋁、VC等(均為分析純)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;紫外-可見近紅外分光光度計 日本島津公司;MODULYOD冷凍真空干燥機 美國ThermoSavant公司;UNICO7200型可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 夏枯草總黃酮的提取分離工藝流程

    夏枯草→60℃烘干,粉碎過40目篩備用→ 提取→抽濾→真空濃縮(50℃)→ 離心(4500r/min,15min)→石油醚萃取→取水層用大孔吸附樹脂分離→冷凍真空干燥,以分析自由基清除活性

    1.3.2 夏枯草總黃酮的超聲波輔助提取工藝分析

    提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1:30 (g/mL)時,分別比較50、60、70、80℃條件下,超聲波輔助浸提15、30、60、120、180min對夏枯草總黃酮得率的影響,分析超聲波輔助提取是否適合于夏枯草總黃酮的提取。

    1.3.3 夏枯草總黃酮的提取工藝優(yōu)化

    實驗發(fā)現(xiàn),超聲波輔助提取不能增加夏枯草總黃酮得率,而且乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比對夏枯草總黃酮得率影響較大。本研究以提取液中夏枯草總黃酮得率為指標(biāo),采用四因素三水平優(yōu)化夏枯草總黃酮的提取工藝,正交試驗設(shè)計見表2。

    1.3.4 夏枯草總黃酮的測定

    蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和總黃酮得率的計算[10]

    回歸方程:Y=0.931X+0.011 (R2=0.9991,Y=吸光度,X=蘆丁質(zhì)量/mg)。

    1.3.5 夏枯草總黃酮的分離[11-13]

    樹脂的預(yù)處理:將樹脂先用95%的乙醇浸泡4h,然后用乙醇洗至流出液加適量水無白色渾濁現(xiàn)象,再用去離子水洗盡醇味,再用5%鹽酸浸泡4h,濾過后去離子洗至近中性,最后用4%氫氧化鈉溶液浸泡4h,并用去離子水洗至中性備用。

    大孔吸附樹脂的吸附性能和解吸性能測定:準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂1g(濾紙吸干)裝入100mL具塞磨口三角瓶中,精密加入一定質(zhì)量濃度的夏枯草總黃酮提取液25mL,置全溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩吸附24h,取一定量上清液測定黃酮含量并計算樹脂吸附量和吸附率。在上述樹脂進行飽和吸附后,將上清液濾去,然后各自加入95%乙醇25mL,并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱震蕩解吸24h,吸取上清液測定解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度并計算解吸率。吸附量(Q)、吸附率(E)和解吸率(X)分別按以下公式計算:

    式中:Ca為吸附前樣液中總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/ mL);Cb為吸附后剩余液中總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL);V為加入的原樣液體積/mL;m為樹脂質(zhì)量/g;Cm為(解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL);Vm為解吸液中的總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

    1.3.6 夏枯草總黃酮的紫外-可見光譜掃描分析

    將夏枯草總黃酮用95%乙醇配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的溶液進行紫外-可見光譜掃描分析。

    1.3.7 DPPH自由基清除活性測定[14-15]

    首先向不同試管中分別加入去離子水或不同質(zhì)量濃度的被測樣品1mL,然后加入1.5mL DPPH乙醇溶液,混勻靜置30min后于517nm比色。同時,為扣除樣品本身顏色,需用無水乙醇代替DPPH乙醇溶液測定各自吸光度。按下式計算DPPH自由基清除率(K)。

    式中:Ai為加試樣(夏枯草總黃酮、VC、BHA)反應(yīng)后DPPH溶液吸光度;Aj為不加DPPH,只加試樣(夏枯草總黃酮、VC、BHA)的溶液的吸光度;Ac為不加試樣,只加DPPH的溶液的吸光度。

    1.3.8 夏枯草總黃酮羥自由基清除活性測定[7]

    [7]的方法基礎(chǔ)上進行了改進,在各試管中依次加入6mmol/L FeSO4溶液0.6mL、去離子水或不同質(zhì)量濃度試樣(夏枯草總黃酮、VC、BHA)溶液2mL、6mmol/L H2O2溶液0.6mL,搖勻,靜置10min,再加入6mmol/L水楊酸溶液0.6mL,搖勻,靜置10min后于510nm處測得空白吸光度Ac和不同試樣(夏枯草總黃酮、VC、BHA)吸光度Ai。同時用水代替水楊酸時測得某試樣質(zhì)量濃度Aj。按下式計算夏枯草總黃酮的羥自由基清除率(R):

    表1 超聲波輔助提取對夏枯草總黃酮得率的影響Table1 Effect of ultrasonic-assisted extraction on extraction rate of flavonoids

    1.3.9 統(tǒng)計分析

    所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值,采用SPSS 13.0分析軟件進行正交設(shè)計的方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 超聲波輔助提取對黃酮得率的影響

    由于超聲波的空化效應(yīng)、熱學(xué)和機械振動效應(yīng),往往會增強活性成分如黃酮、多糖和生物堿等的提取效率。而表1顯示,在不同溫度和不同時間條件下,超聲波輔助提取都不能增加夏枯草總黃酮得率,而且,得率在超聲波輔助提取條件下略有減少的趨勢。這可能與夏枯草總黃酮類型、存在形式和超聲波提取功率有關(guān),需要用可調(diào)頻率和功率的超聲波提取器進行進一步驗證分析。

    2.2 正交試驗設(shè)計結(jié)果直觀分析和方差分析

    表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal experiments

    從表2中的極差分析可知,影響黃酮得率因素的主次順序依次是料液比>提取溫度>提取時間>乙醇體積分?jǐn)?shù);最優(yōu)組合為A1B3C3D3,即料液比1:30、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度為80℃、時間3h。

    正交試驗的直觀分析法簡便、直觀、計算量小,但不能估計試驗誤差,需要對試驗結(jié)果進行方差分析。由表3可知,各因素對試驗結(jié)果的影響程度是料液比>提取溫度>提取時間>乙醇體積分?jǐn)?shù),料液比具有顯著性差異,這與直觀分析結(jié)果相吻合。

    表3 正交設(shè)計試驗方差分析表Table3 Variance analysis of orthogonal experiments

    2.3 大孔吸附樹脂對夏枯草總黃酮的吸附效果

    在相同條件下,吸附樹脂的種類、結(jié)構(gòu)、表面積,以及孔隙率不同,不但吸附能力不同,其解吸能力也是不同的。表4表明,弱極性大孔吸附樹脂AB-8吸附容量最大,其值為55.65mg/g樹脂,解吸率為72.89%。非極性大孔樹脂D101和X-5的吸附容量和解吸率都顯著低于AB-8。極性大孔吸附樹脂DA-201的解吸率雖然最高,但其吸附量和吸附率都低于AB-8弱極性大孔吸附樹脂。綜合分析認(rèn)為AB-8適合于分離夏枯草總黃酮。

    表4 不同類型樹脂種樹脂對夏枯草總黃酮的吸附量及解吸率Table4 Effects of different macroporous resins on absorption and desorption rates of flavonoids

    2.4 夏枯草總黃酮的紫外可見光譜掃描曲線

    圖1 夏枯草總黃酮的紫外-可見掃描光譜曲線Fig.1 UV-visible spectral scanning of flavonoids from Prunella vulgaris Linn

    圖1 顯示,夏枯草總黃酮在275~295nm之間和300~330nm之間有吸收峰、肩峰,說明它們可能為黃烷酮和雙氫黃酮醇類。

    2.5 夏枯草總黃酮DPPH自由基和羥自由基清除活性

    圖2 不同抗氧化劑對DPPH自由基的清除活性Fig.2 Scavenging rates of different antioxidants on DPPH free radicals

    圖3 不同抗氧化劑對羥自由基的清除活性Fig.3 Scavenging rates of different antioxidants on hydroxyl free radicals

    圖2 、3顯示出夏枯草總黃酮、VC和BHA對DPPH自由基和羥自由基的清除率都隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增加。對于DPPH自由基,在各試樣質(zhì)量濃度小于6μg/mL時,清除率由大到小的順序分別為VC、BHA和夏枯草總黃酮,而當(dāng)試樣質(zhì)量濃度大于6μg/mL時,夏枯草總黃酮的DPPH自由基清除率卻大于BHA,質(zhì)量濃度越高,清除率越接近于VC,當(dāng)質(zhì)量濃度超過82μg/mL時,其DPPH自由基清除率超過90%,而BHA對DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而緩慢增加,在所測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的自由基清除率都小于80%。對于羥自由基,VC高于夏枯草總黃酮高于BHA,在質(zhì)量濃度為0.83mg/ mL時,夏枯草總黃酮對羥自由基的清除活性接近VC,清除率大于92%,幾乎是BHA的1倍。

    3 結(jié) 論

    在不同時間和不同溫度條件下,超聲波輔助提取都不能增強夏枯草總黃酮得率。夏枯草總黃酮最佳提取工藝:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:30(g/mL)、時間3h、溫度80℃,得率5.05%。弱極性大孔吸附樹脂AB-8比非極性大孔吸附樹脂更適合于分離夏枯草總黃酮。該黃酮可能屬于黃烷酮和雙氫黃酮醇類。夏枯草總黃酮對DPPH自由基和羥自由基的清除活性都隨質(zhì)量濃度的升高而增加,質(zhì)量濃度越高,夏枯草總黃酮的自由基清除活性越接近VC,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BHA。為進一步了解夏枯草總黃酮與自由基清除活性的構(gòu)效關(guān)系,下一步需要通過化學(xué)或柱層析分離各類黃酮,并進行活性和結(jié)構(gòu)分析。

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    Extraction, Isolation and Free Radical-Scavenging Activity of Flavonoids from Prunella vulgaris Linn

    XIONG Shuang-li,LI An-lin
    (College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

    The aims of this study are to explore the effect of ultrasonic-assisted extraction on extraction rate of flavonoids from Prunella vulgaris Linn, optimize extraction processing of flavonoids using orthogonal experiments, screen appropriate macroporous resin for flavonoid purification, and investigate the scavenging capability of flavonoids on free radicals. Results indicated that ultrasonic-assisted extraction did not increase the extraction rate of flavonoids from Prunella vulgaris Linn. The optimal extraction conditions were ethanol concentration of 50%, material-liquid ratio of 1:30, extraction temperature of 80 ℃and extraction time of 3 h. The extraction rate of total flavonoids was up to 5.05% under the optimal conditions. Meanwhile, macroporous resin AB-8 was suitable for the separation of total flavonoids. UV-visible spectrum exhibited that flavanone and dihydroflavonol were the major components. The scavenging capability of total flavonoids from Prunella vulgaris Linn on DPPH and hydroxyl free radicals was a concentration-dependent manner, which was close to the scavenging capability of ascorbic acid and higher than that of tert-butylated hydroxyanisonle (BHA).

    Prunella vulgaris Linn;flavonoids;free radical;isolation and purification

    TQ929.2

    A

    1002-6630(2010)22-0194-04

    2010-01-09

    西南科技大學(xué)國防重點學(xué)科實驗室重點培育項目(07JGZB18)

    熊雙麗(1977—),女,副教授,博士,研究方向為碳水化合物與生物技術(shù)。E-mail:lxberry225@yahoo.com.cn

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