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    夏枯草總黃酮的提取分離與自由基清除活性研究

    2010-03-23 02:04:51熊雙麗李安林
    食品科學(xué) 2010年22期
    關(guān)鍵詞:黃酮質(zhì)量

    熊雙麗,李安林

    (西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010)

    夏枯草總黃酮的提取分離與自由基清除活性研究

    熊雙麗,李安林

    (西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010)

    分析超聲波輔助提取對(duì)夏枯草總黃酮得率的影響,采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化總黃酮提取工藝,篩選適合于分離總黃酮的大孔吸附樹(shù)脂,最后研究其自由基清除活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):超聲波輔助提取不能提高夏枯草總黃酮得率,最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:30(g/mL)、時(shí)間3h、溫度80℃,得率可達(dá)5.05%;大孔吸附樹(shù)脂AB-8適合于分離夏枯草總黃酮;紫外-可見(jiàn)光譜分析其可能為黃烷酮和雙氫黃酮醇類(lèi);隨質(zhì)量濃度增加,夏枯草總黃酮的DPPH自由基和羥自由基清除活性越接近VC,當(dāng)質(zhì)量濃度分別大于82μg/mL和0.83mg/mL時(shí),兩者的清除率都大于90%,顯著高于叔丁基羥基茴香醚。

    夏枯草;黃酮;自由基;分離純化

    抗氧化劑不僅能防止食品氧化,提高保鮮效果,還有許多預(yù)防和保健功能。由于合成抗氧化劑如BHT和BHA的安全性問(wèn)題,以及人們對(duì)健康食品的要求,開(kāi)發(fā)安全性的高活性天然抗氧化劑已成為當(dāng)前迫切的研究課題[1-3]。夏枯草(Prunella vulgaris Linn)主要含有三萜、甾醇、黃酮類(lèi)、香豆素及糖類(lèi)等,具有降壓、抗病毒、及抗腫瘤等多種藥理作用[4-6],為進(jìn)一步了解其化學(xué)成分與生物活性之間的關(guān)系和控制其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)其多糖、三萜類(lèi)化合物及香豆素研究甚多,而關(guān)于黃酮類(lèi)化合物的提取分離及生物活性研究還處于相當(dāng)滯后的狀態(tài),廖麗等[7]發(fā)現(xiàn)不同居群夏枯草總黃酮含量變異幅度2.16%~10.29%。袁萍等[8]認(rèn)為非極性大孔吸附樹(shù)脂D-101適合用于夏枯草總黃酮的分離純化。杜輝等[9]卻發(fā)現(xiàn)弱極性大孔吸附樹(shù)脂AB-8適合于夏枯草總黃酮的分離。本實(shí)驗(yàn)首先分析超聲波輔助提取對(duì)夏枯草總黃酮得率的影響,再采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化夏枯草總黃酮提取工藝,再篩選適合于分離夏枯草總黃酮的大孔吸附樹(shù)脂,最后研究其對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除活性,為夏枯草總黃酮的構(gòu)效關(guān)系及應(yīng)用研究提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    夏枯草 涪江中藥飲片廠。蘆丁對(duì)照品 南京替斯艾么中藥研究所;DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基)、叔丁基羥基茴香醚(BHA) Sigma公司;D-101、AB-8、X-5、DA-201 天津海光化工有限公司;乙醇、硝酸鋁、VC等(均為分析純)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;紫外-可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì) 日本島津公司;MODULYOD冷凍真空干燥機(jī) 美國(guó)ThermoSavant公司;UNICO7200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司;超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 夏枯草總黃酮的提取分離工藝流程

    夏枯草→60℃烘干,粉碎過(guò)40目篩備用→ 提取→抽濾→真空濃縮(50℃)→ 離心(4500r/min,15min)→石油醚萃取→取水層用大孔吸附樹(shù)脂分離→冷凍真空干燥,以分析自由基清除活性

    1.3.2 夏枯草總黃酮的超聲波輔助提取工藝分析

    提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、料液比為1:30 (g/mL)時(shí),分別比較50、60、70、80℃條件下,超聲波輔助浸提15、30、60、120、180min對(duì)夏枯草總黃酮得率的影響,分析超聲波輔助提取是否適合于夏枯草總黃酮的提取。

    1.3.3 夏枯草總黃酮的提取工藝優(yōu)化

    實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),超聲波輔助提取不能增加夏枯草總黃酮得率,而且乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)夏枯草總黃酮得率影響較大。本研究以提取液中夏枯草總黃酮得率為指標(biāo),采用四因素三水平優(yōu)化夏枯草總黃酮的提取工藝,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

    1.3.4 夏枯草總黃酮的測(cè)定

    蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和總黃酮得率的計(jì)算[10]

    回歸方程:Y=0.931X+0.011 (R2=0.9991,Y=吸光度,X=蘆丁質(zhì)量/mg)。

    1.3.5 夏枯草總黃酮的分離[11-13]

    樹(shù)脂的預(yù)處理:將樹(shù)脂先用95%的乙醇浸泡4h,然后用乙醇洗至流出液加適量水無(wú)白色渾濁現(xiàn)象,再用去離子水洗盡醇味,再用5%鹽酸浸泡4h,濾過(guò)后去離子洗至近中性,最后用4%氫氧化鈉溶液浸泡4h,并用去離子水洗至中性備用。

    大孔吸附樹(shù)脂的吸附性能和解吸性能測(cè)定:準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂1g(濾紙吸干)裝入100mL具塞磨口三角瓶中,精密加入一定質(zhì)量濃度的夏枯草總黃酮提取液25mL,置全溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩吸附24h,取一定量上清液測(cè)定黃酮含量并計(jì)算樹(shù)脂吸附量和吸附率。在上述樹(shù)脂進(jìn)行飽和吸附后,將上清液濾去,然后各自加入95%乙醇25mL,并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱震蕩解吸24h,吸取上清液測(cè)定解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度并計(jì)算解吸率。吸附量(Q)、吸附率(E)和解吸率(X)分別按以下公式計(jì)算:

    式中:Ca為吸附前樣液中總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/ mL);Cb為吸附后剩余液中總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL);V為加入的原樣液體積/mL;m為樹(shù)脂質(zhì)量/g;Cm為(解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL);Vm為解吸液中的總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

    1.3.6 夏枯草總黃酮的紫外-可見(jiàn)光譜掃描分析

    將夏枯草總黃酮用95%乙醇配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描分析。

    1.3.7 DPPH自由基清除活性測(cè)定[14-15]

    首先向不同試管中分別加入去離子水或不同質(zhì)量濃度的被測(cè)樣品1mL,然后加入1.5mL DPPH乙醇溶液,混勻靜置30min后于517nm比色。同時(shí),為扣除樣品本身顏色,需用無(wú)水乙醇代替DPPH乙醇溶液測(cè)定各自吸光度。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率(K)。

    式中:Ai為加試樣(夏枯草總黃酮、VC、BHA)反應(yīng)后DPPH溶液吸光度;Aj為不加DPPH,只加試樣(夏枯草總黃酮、VC、BHA)的溶液的吸光度;Ac為不加試樣,只加DPPH的溶液的吸光度。

    1.3.8 夏枯草總黃酮羥自由基清除活性測(cè)定[7]

    [7]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),在各試管中依次加入6mmol/L FeSO4溶液0.6mL、去離子水或不同質(zhì)量濃度試樣(夏枯草總黃酮、VC、BHA)溶液2mL、6mmol/L H2O2溶液0.6mL,搖勻,靜置10min,再加入6mmol/L水楊酸溶液0.6mL,搖勻,靜置10min后于510nm處測(cè)得空白吸光度Ac和不同試樣(夏枯草總黃酮、VC、BHA)吸光度Ai。同時(shí)用水代替水楊酸時(shí)測(cè)得某試樣質(zhì)量濃度Aj。按下式計(jì)算夏枯草總黃酮的羥自由基清除率(R):

    表1 超聲波輔助提取對(duì)夏枯草總黃酮得率的影響Table1 Effect of ultrasonic-assisted extraction on extraction rate of flavonoids

    1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

    所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值,采用SPSS 13.0分析軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)的方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 超聲波輔助提取對(duì)黃酮得率的影響

    由于超聲波的空化效應(yīng)、熱學(xué)和機(jī)械振動(dòng)效應(yīng),往往會(huì)增強(qiáng)活性成分如黃酮、多糖和生物堿等的提取效率。而表1顯示,在不同溫度和不同時(shí)間條件下,超聲波輔助提取都不能增加夏枯草總黃酮得率,而且,得率在超聲波輔助提取條件下略有減少的趨勢(shì)。這可能與夏枯草總黃酮類(lèi)型、存在形式和超聲波提取功率有關(guān),需要用可調(diào)頻率和功率的超聲波提取器進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

    2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果直觀分析和方差分析

    表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal experiments

    從表2中的極差分析可知,影響黃酮得率因素的主次順序依次是料液比>提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù);最優(yōu)組合為A1B3C3D3,即料液比1:30、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度為80℃、時(shí)間3h。

    正交試驗(yàn)的直觀分析法簡(jiǎn)便、直觀、計(jì)算量小,但不能估計(jì)試驗(yàn)誤差,需要對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。由表3可知,各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度是料液比>提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù),料液比具有顯著性差異,這與直觀分析結(jié)果相吻合。

    表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方差分析表Table3 Variance analysis of orthogonal experiments

    2.3 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)夏枯草總黃酮的吸附效果

    在相同條件下,吸附樹(shù)脂的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、表面積,以及孔隙率不同,不但吸附能力不同,其解吸能力也是不同的。表4表明,弱極性大孔吸附樹(shù)脂AB-8吸附容量最大,其值為55.65mg/g樹(shù)脂,解吸率為72.89%。非極性大孔樹(shù)脂D101和X-5的吸附容量和解吸率都顯著低于AB-8。極性大孔吸附樹(shù)脂DA-201的解吸率雖然最高,但其吸附量和吸附率都低于AB-8弱極性大孔吸附樹(shù)脂。綜合分析認(rèn)為AB-8適合于分離夏枯草總黃酮。

    表4 不同類(lèi)型樹(shù)脂種樹(shù)脂對(duì)夏枯草總黃酮的吸附量及解吸率Table4 Effects of different macroporous resins on absorption and desorption rates of flavonoids

    2.4 夏枯草總黃酮的紫外可見(jiàn)光譜掃描曲線

    圖1 夏枯草總黃酮的紫外-可見(jiàn)掃描光譜曲線Fig.1 UV-visible spectral scanning of flavonoids from Prunella vulgaris Linn

    圖1 顯示,夏枯草總黃酮在275~295nm之間和300~330nm之間有吸收峰、肩峰,說(shuō)明它們可能為黃烷酮和雙氫黃酮醇類(lèi)。

    2.5 夏枯草總黃酮DPPH自由基和羥自由基清除活性

    圖2 不同抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig.2 Scavenging rates of different antioxidants on DPPH free radicals

    圖3 不同抗氧化劑對(duì)羥自由基的清除活性Fig.3 Scavenging rates of different antioxidants on hydroxyl free radicals

    圖2 、3顯示出夏枯草總黃酮、VC和BHA對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率都隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增加。對(duì)于DPPH自由基,在各試樣質(zhì)量濃度小于6μg/mL時(shí),清除率由大到小的順序分別為VC、BHA和夏枯草總黃酮,而當(dāng)試樣質(zhì)量濃度大于6μg/mL時(shí),夏枯草總黃酮的DPPH自由基清除率卻大于BHA,質(zhì)量濃度越高,清除率越接近于VC,當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)82μg/mL時(shí),其DPPH自由基清除率超過(guò)90%,而B(niǎo)HA對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而緩慢增加,在所測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的自由基清除率都小于80%。對(duì)于羥自由基,VC高于夏枯草總黃酮高于BHA,在質(zhì)量濃度為0.83mg/ mL時(shí),夏枯草總黃酮對(duì)羥自由基的清除活性接近VC,清除率大于92%,幾乎是BHA的1倍。

    3 結(jié) 論

    在不同時(shí)間和不同溫度條件下,超聲波輔助提取都不能增強(qiáng)夏枯草總黃酮得率。夏枯草總黃酮最佳提取工藝:乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:30(g/mL)、時(shí)間3h、溫度80℃,得率5.05%。弱極性大孔吸附樹(shù)脂AB-8比非極性大孔吸附樹(shù)脂更適合于分離夏枯草總黃酮。該黃酮可能屬于黃烷酮和雙氫黃酮醇類(lèi)。夏枯草總黃酮對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除活性都隨質(zhì)量濃度的升高而增加,質(zhì)量濃度越高,夏枯草總黃酮的自由基清除活性越接近VC,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BHA。為進(jìn)一步了解夏枯草總黃酮與自由基清除活性的構(gòu)效關(guān)系,下一步需要通過(guò)化學(xué)或柱層析分離各類(lèi)黃酮,并進(jìn)行活性和結(jié)構(gòu)分析。

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    Extraction, Isolation and Free Radical-Scavenging Activity of Flavonoids from Prunella vulgaris Linn

    XIONG Shuang-li,LI An-lin
    (College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

    The aims of this study are to explore the effect of ultrasonic-assisted extraction on extraction rate of flavonoids from Prunella vulgaris Linn, optimize extraction processing of flavonoids using orthogonal experiments, screen appropriate macroporous resin for flavonoid purification, and investigate the scavenging capability of flavonoids on free radicals. Results indicated that ultrasonic-assisted extraction did not increase the extraction rate of flavonoids from Prunella vulgaris Linn. The optimal extraction conditions were ethanol concentration of 50%, material-liquid ratio of 1:30, extraction temperature of 80 ℃and extraction time of 3 h. The extraction rate of total flavonoids was up to 5.05% under the optimal conditions. Meanwhile, macroporous resin AB-8 was suitable for the separation of total flavonoids. UV-visible spectrum exhibited that flavanone and dihydroflavonol were the major components. The scavenging capability of total flavonoids from Prunella vulgaris Linn on DPPH and hydroxyl free radicals was a concentration-dependent manner, which was close to the scavenging capability of ascorbic acid and higher than that of tert-butylated hydroxyanisonle (BHA).

    Prunella vulgaris Linn;flavonoids;free radical;isolation and purification

    TQ929.2

    A

    1002-6630(2010)22-0194-04

    2010-01-09

    西南科技大學(xué)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)培育項(xiàng)目(07JGZB18)

    熊雙麗(1977—),女,副教授,博士,研究方向?yàn)樘妓衔锱c生物技術(shù)。E-mail:lxberry225@yahoo.com.cn

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