半抗原免疫分析在食品安全檢測中的應(yīng)用

張小鶯，趙津子，陳 琛，韓水仲，田澤華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000)

半抗原免疫分析在食品安全檢測中的應(yīng)用

張小鶯1，趙津子1，陳 琛2，韓水仲1，田澤華1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000)

綜述近幾年來關(guān)于小分子半抗原的設(shè)計、人工抗原合成的研究，以及人工抗原合成中尚存在的問題和計算機模擬技術(shù)在半抗原合成中的應(yīng)用；介紹多克隆抗體、單克隆抗體、卵黃抗體及基因工程抗體在食品安全檢測中的應(yīng)用，分析近年來ELISA、膠體金免疫層析和新興的免疫傳感器技術(shù)研究與應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢。半抗原免疫學(xué)檢測方法具有較低的檢測極限、快速、方便、低廉等優(yōu)勢，是食品安全檢測的發(fā)展方向。半抗原合成的可控設(shè)計、有效抗體的規(guī)?；a(chǎn)，通過與新型免疫分析技術(shù)結(jié)合以期達到高通量、低成本、實時多重檢測是今后食品安全免疫學(xué)檢測中重要的技術(shù)突破點。

免疫分析法；半抗原；食品安全

食品安全與人類健康有直接關(guān)系，近年來因食用受到嚴重污染的食品而造成中毒的事件屢有發(fā)生，使人們對食品安全問題越來越重視。目前對食品中主要污染物，尤其是藥物殘留的檢測主要包括兩個方向：1)色譜、質(zhì)譜、紫外、紅外等以儀器為主的確證檢測方法；2)ELISA試劑盒、膠體金檢測試紙條、免疫傳感器等免疫學(xué)快速篩選檢測技術(shù)。儀器檢測所需成本高、樣品前處理較繁瑣、對操作人員素質(zhì)要求高、不適合大量樣品的篩選和檢測，不適于現(xiàn)場監(jiān)測。而免疫分析法(immunoassay，IA)快速、簡便、靈敏，一般不需要貴重儀器，可大大簡化樣品前處理過程，對使用人員的專門技術(shù)要求不高，易普及和推廣，尤其適宜現(xiàn)場篩選和大量樣品的快速分析，IA以其獨特的優(yōu)勢在食品安全檢測中占有重要地位。本文綜述免疫學(xué)方法在食品安全檢測領(lǐng)域的研究與應(yīng)用，并對今后的發(fā)展趨勢進行分析。

1 食品小分子污染物免疫分析法(IA)的原理

IA是將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測試手段相結(jié)合而建立的超微量測定技術(shù)。待檢的食品污染物如獸藥殘留、農(nóng)藥殘留、食品添加劑、部分生物毒素、食品增色劑等，它們分子質(zhì)量都較小，僅具有與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細胞的反應(yīng)原性，而無免疫原性，通常不能激發(fā)免疫反應(yīng)，稱之為半抗原。但半抗原通過一定長度的碳鏈與載體蛋白結(jié)合后得到的人工抗原可刺激動物機體產(chǎn)生特異性的抗體，這為食品小分子污染物檢測提供了新的發(fā)展方向。小分子食品污染物免疫檢測的開發(fā)包括以下幾個步驟：目標(biāo)分析物確定，設(shè)計并合成半抗原，半抗原與載體蛋白連接合成人工抗原，人工抗原免疫動物制備抗體，建立目標(biāo)分析物的免疫學(xué)檢測方法。IA以抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，因此人工抗原刺激機體產(chǎn)生抗體親和力的高低是建立IA的決定因素。

2 小分子食品污染物人工抗原的合成

2.1 半抗原的設(shè)計

半抗原潛在免疫特性的高低主要取決于基團結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、結(jié)構(gòu)中環(huán)的數(shù)目、雜原子的數(shù)目和不均一性。通常結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、分子質(zhì)量較大的半抗原在進一步免疫實驗中較易成功，而分子質(zhì)量較小和化學(xué)結(jié)構(gòu)過于簡單的半抗原較難誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗體，但也有成功的。Tuomola等[1]用分子質(zhì)量僅為131D的3-甲基吲哚上的羰基與較長的連接臂連接，合成9個人工抗原，進一步篩選得到特異性單抗。

半抗原設(shè)計的目的是使半抗原刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并獲得對待測物有高親和力的抗體。半抗原設(shè)計時免疫原中半抗原的分子結(jié)構(gòu)、立體化學(xué)、電子分布應(yīng)與待測物盡可能相似。此外，為突出待測物分子的特征結(jié)構(gòu)，設(shè)計時常在特征結(jié)構(gòu)和載體蛋白之間引入一定長度的連接分子，即連接臂。通常認為連接臂的最適長度在3～6個碳原子[2]，如連接臂太短或缺失，半抗原有可能被載體蛋白的三維結(jié)構(gòu)掩蓋而不利于其充分暴露，過長又會因疏水作用而造成半抗原分子構(gòu)型折疊，導(dǎo)致半抗原分子靠近載體蛋白表面而被屏蔽，不利于抗原遞呈細胞的識別。間隔臂的長度對分析的靈敏度及所產(chǎn)生的抗體對半抗原本身的識別情況都有影響。

引入連接臂位點的選擇產(chǎn)生抗體的特異性有很大的影響。如果待測半抗原有多個可供選擇的偶聯(lián)位點，則可嘗試利用多個位點分別合成多種人工抗原，然后篩選出較理想的人工抗原。不同的偶聯(lián)位點會導(dǎo)致分子極性、構(gòu)型、電子云分布及空間構(gòu)型的不同，從而可能引起免疫系統(tǒng)識別不同的抗原決定簇。

此外，根據(jù)測定對象是單一半抗原或是一組結(jié)構(gòu)相似的半抗原，設(shè)計中應(yīng)考慮突出特定半抗原的結(jié)構(gòu)或一組半抗原中共有的特征結(jié)構(gòu)部分。Xu等[3]設(shè)計的具有硫代磷酸根和苯環(huán)的非特異性半抗原產(chǎn)生的廣譜抗體對7種常用的有機磷農(nóng)藥都有較高的敏感性。

2.2 人工抗原的合成

2.2.1 載體蛋白的選擇

目前常用載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)、雞卵溶菌酶(HEL)[4]等。BSA因其物化性質(zhì)穩(wěn)定、不易變性、價廉易得，而且其賴氨酸含量高(即半抗原與載體的偶聯(lián)密度較大)，而使用最多。

一般認為自身蛋白不適宜作為免疫載體。但有研究表明機體仍存在針對某些自身蛋白的T細胞克隆，吳瑜等[5]認為自身蛋白作為載體不僅可以消除載體本身B細胞表位的干擾，還可以避免異源蛋白作為載體引起的一些過敏反應(yīng)，所以自身蛋白也有作為免疫蛋白的潛力。

選擇的載體不應(yīng)與檢測體系中的成分發(fā)生交叉反應(yīng)，如需要將人工抗原的抗體用于血液學(xué)檢測中，就不應(yīng)選用BSA、OVA、HSA、兔血清白蛋白(RSA)，但可用多聚賴氨酸(PLL)作為載體。在ELISA實驗中免疫用人工抗原與包被用人工抗原所采用的載體蛋白應(yīng)不同，以避免其干擾檢測[6]。陳繼明等[7]認為免疫原和包被原所用載體蛋白結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量差異越大，非特異性結(jié)合反應(yīng)越弱，分析靈敏度越高。

2.2.2 人工抗原的合成方法

半抗原與載體偶聯(lián)時應(yīng)根據(jù)半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以及反應(yīng)方式選擇適當(dāng)?shù)呐悸?lián)方法，偶聯(lián)時應(yīng)保證半抗原的活性及理化性質(zhì)不發(fā)生改變。常見的偶聯(lián)方法有混合酸酐法、碳二亞胺法、戊二醛法、重氮法等。江媛媛等[8]首次用1,4-丁二醇二縮水甘油醚(雙環(huán)氧試劑)為偶聯(lián)劑運用雙交聯(lián)法制備桔霉素-蛋白偶聯(lián)抗原，免疫BALB/C小鼠，獲得抗桔霉素多克隆抗體效價達到1.1×105。

針對不含氨基和羧基的半抗原，還可以通過引入羧基和改造反應(yīng)基團實現(xiàn)偶聯(lián)。具體方法選用要視半抗原所具有的官能團的結(jié)構(gòu)而定，在半抗原和蛋白的偶聯(lián)過程中還應(yīng)充分考慮到半抗原與載體的比例，偶聯(lián)時pH值、溫度、光照、滲透壓、加樣速度等條件對偶聯(lián)效果的影響。

2.2.3 人工抗原的鑒定

對于人工抗原的鑒定，目前采用的方法有：紫外吸收法、標(biāo)記抗原示蹤法和SDS-PAGE等。這些方法操作均比較繁瑣，結(jié)果準(zhǔn)確性較差。常用的紫外吸收法要求小分子化合物要有紫外吸收，否則無法確定，且針對不同的小分子化合物計算方法存在許多差異。張淑

玲等[9]根據(jù)公式{[A325nm(結(jié)合物)－A325nm(牛血清白蛋白)]/ ε325nm(諾氟沙星)}/牛血清白蛋白的濃度(mol/L)=諾氟沙星與牛血清白蛋白的偶聯(lián)率。劉悅竹等[10]根據(jù)公式：結(jié)合比=[ε232(結(jié)合物)－ε232(載體蛋白)]/ε232(半抗原)(式中：ε為摩爾消光系數(shù))計算有機磷農(nóng)藥與載體蛋白的結(jié)合比。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜測定人工抗原與載體的偶聯(lián)比操作簡單，微量樣品點到靶上即可開始測定，幾秒后可得到譜圖和數(shù)據(jù)，根據(jù)分子質(zhì)量的變化簡單計算即得偶聯(lián)比。該方法簡便、快速、且結(jié)果準(zhǔn)確，值得推廣。

半抗原與載體的偶聯(lián)存在最佳比例，較高偶聯(lián)比的人工抗原能夠較快的誘導(dǎo)產(chǎn)生較高效價的抗體，但是偶聯(lián)比過大會影響抗體的親和性和特異性[11]，一般來說當(dāng)偶聯(lián)比為3:1～45:1時免疫原性較強。

2.2.4 人工抗原合成的現(xiàn)狀

目前，人工抗原的合成仍是以大量篩選的“試錯法”為主，即預(yù)先設(shè)計幾個人工抗原免疫動物，通過獲得的抗體來評價人工抗原的優(yōu)劣，這些設(shè)計方法工作量大且?guī)в泻艽蟮慕?jīng)驗性和隨意性，影響了抗體的效價與開發(fā)的可控性。計算機輔助分子建模(computer-assisted molecular modeling，CAMM)等手段的出現(xiàn)，為人工抗原的合成提供了新的發(fā)展方向。CAMM是通過X-單晶衍射等技術(shù)或已有實驗數(shù)據(jù)獲得化合物的三維結(jié)構(gòu)、電子分布與電子特性、空間位阻、疏水性、熱力學(xué)穩(wěn)定性等信息，利用分子力學(xué)、分子動力學(xué)和量子力學(xué)等理論確定分子構(gòu)象或者相關(guān)的分子間相互作用以及動態(tài)行為，進而可視化的顯示這種空間模型或相互作用[12]。Galve等[13]用CAMM對氯苯酚類化合的半抗原設(shè)計進行了系列研究，比較預(yù)先設(shè)計的3種半抗原偶聯(lián)物空間結(jié)構(gòu)及電子構(gòu)型與待分析物(2,4,6-三氯苯酚)的區(qū)別，并通過主成分分析(principal component analysis，PCA)篩選出與目標(biāo)分析物具有最大相似度的半抗原，通過Hyperchem軟件優(yōu)化分子構(gòu)型，得到最穩(wěn)定的分子構(gòu)象，并從熱力學(xué)角度比較半抗原之間的差異，篩選出與2,4,6-三氯苯酚具有最大相似度的半抗原，免疫動物獲得的抗體對目標(biāo)分析物具有較高的敏感性和特異性，IC50為(2.76±0.26)μg/L。抗原-抗體的相互作用是基于由分子電子特性所決定的原子空間排列及相互作用，運用CAMM可以更為合理的解釋實驗前不能預(yù)料的交叉反應(yīng)率的結(jié)果，從而幫助改進半抗原的設(shè)計，提高抗體的親和力以及廣譜性[14]。在一些研究中[15-17]，CAMM幫助研究者提高了抗體的廣譜性，如Wang等[15]開發(fā)的一種廣譜特異性單克隆抗體與氟喹諾酮類的12種抗生素都呈現(xiàn)較高的交叉反應(yīng)率(30%～100%)。通過CAMM考察目標(biāo)化合物的共同構(gòu)型和電子特性，預(yù)測具有待分析物共同結(jié)構(gòu)而非單個化合物特異結(jié)構(gòu)的半抗原，從而獲得廣譜性的抗體，為多殘留免疫檢測方法的發(fā)展提供了一條新的思路。

3 半抗原抗體類型

3.1 多克隆抗體

多抗制備簡單、價格低廉，但由于半抗原-載體復(fù)合物有多個結(jié)合位點，免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生具有不同特異性的多抗，故可在免疫檢測使用之前通過親和層析等純化手段提高抗體的特異性與均質(zhì)性，這也限制了多抗的應(yīng)用。

3.2 單克隆抗體(mAb)

單抗特異性強、高度均質(zhì)和易于標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用于藥殘分析篩選具有特異、靈敏、快速、簡便、痕量檢測，以及可大批量樣本檢測的優(yōu)點，在IA檢測法中已得到較廣泛的應(yīng)用。

3.3 卵黃抗體(IgY)

IgY是指從免疫禽蛋中提取的針對特定抗原的多抗。IgY產(chǎn)量高(1只蛋雞每周的抗體產(chǎn)量相當(dāng)于9～10只兔同期抗體產(chǎn)量)、易于獲得、使用方便、理化性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉、抗體表達時間長且平穩(wěn)、又符合動物福利原則。更為重要的是，IgY因其物種距離而帶來一系列抗體特性優(yōu)勢，與哺乳動物成分交叉反應(yīng)少，可減少假陽性的產(chǎn)生，尤其適合于檢測、診斷試劑的開發(fā)[18]。桔霉素(CIT)是由青霉菌屬和曲霉菌屬的某些菌株產(chǎn)生的真菌毒素[19]。桔霉素具有嚴重的致畸、致癌和誘發(fā)基因突變等作用，人和動物食用含用CIT的食物后會造成肝腎損傷[20]。Duan等[21]用CIT人工抗原免疫雞產(chǎn)生的IgY建立間接ELISA法檢測CIT最低檢測限為10ng/mL，抗CIT IgY與CIT替代物赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B和脫氧萎鐮菌醇的交叉反應(yīng)率分別為0.08%、0.05%和0.02%。

在多克隆IgY的基礎(chǔ)上還可以引入一種單克隆IgY (mIgY)的概念，這種抗體兼具IgY種屬距離優(yōu)勢和單抗的高特異性與表達穩(wěn)定性，抗體的專一性將進一步加強。陳紅秀等[22]在文章中具體闡述了mIgY的研發(fā)思路，若將其應(yīng)用在食品安全檢測中有望進一步提高檢測的特異性與靈敏性。

3.4 基因工程抗體

通過基因工程方法可以從細胞系中直接克隆、篩選到抗體基因，并進一步進行定向改造，如提高抗體的親和力等，Moghaddam等[23]制備的黃曲霉毒素單鏈抗體親和力為6×10-9mol/L。同時篩選得到的抗體基因可以在宿主細胞中表達，方便抗體的大規(guī)模生產(chǎn)?；蚬こ炭贵w的制備與研究開發(fā)可以在一定程度上解決半抗原抗體制備難的問題。與多抗和單抗相比，基因工程抗體的篩選范圍廣、生產(chǎn)周期短、操作簡便、生產(chǎn)成本低[24]。

4 免疫學(xué)檢測方法在食品安全檢測中的應(yīng)用

4.1 酶聯(lián)免疫檢測方法(ELISA)

ELISA是目前食品安全檢測常用的免疫分析法，可定性和定量檢測。早在1995年，歐盟就已禁止蘇丹紅作為食品添加劑使用，但由于其成本較低，增色效果突出，在食品中仍時有非法添加，對人體健康造成威脅。Wang等[25]建立的基于高特異性抗蘇丹紅Ⅰ單抗的ELISA法檢測限達0.07～0.14ng/mL，與蘇丹紅Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的交叉反應(yīng)率分別為9.5%、33.9%和0.95%。Strasser等[26]利用磺胺嘧啶的單抗建立的ELISA對牛奶中磺胺嘧啶殘留最低檢測極限達9ng/mL。目前已有許多商品化的ELISA試劑盒可初步檢測食品中存在的小分子污染物，但ELISA操作步驟繁多，延長了檢測時間，且成本較高。

4.2 膠體金免疫層析檢測

將小分子半抗原抗體用金顆粒標(biāo)記形成金標(biāo)抗體，半抗原與其人工抗原競爭性結(jié)合金標(biāo)抗體，從而使檢測線和質(zhì)控線由于樣品中所含藥物量的不同呈現(xiàn)不同顏色。傳統(tǒng)膠體金檢測只能定性，或通過反應(yīng)顏色深淺半定量，檢測的靈敏度也不高，檢測范圍有待于進一步擴寬。但也可通過以下方式實現(xiàn)膠體金定量檢測：1)檢測線的設(shè)計只能結(jié)合一定量的分析物，任何過量的分析物將會和下一條檢測線結(jié)合，產(chǎn)生一個溫度計式的條帶梯度；2)應(yīng)用光密度計測量顯色帶的顏色強度，將顏色強度轉(zhuǎn)為數(shù)字化指標(biāo)實現(xiàn)定量檢測。Lisa等[27]運用建立了IgY抗體膠體金的試紙條檢測有機磷殺蟲劑DDT的殘留，最低檢測限為27ng/mL。

膠體金試紙條還可采用多膜復(fù)合或單模多元受體固定實現(xiàn)多元檢測。Kranthi等[28]建立了在一條膠體金檢測試紙條固定擬除蟲菊酯-蛋白和硫丹-蛋白來同時檢測樣品中擬除蟲菊酯和硫丹的殘留。

目前許多商品化的膠體金試紙條檢測食品中的小分子污染物方便、敏感、特異、無污染，檢測時間僅需5～10min，非常適合現(xiàn)場檢測，可用于大量樣品的快速篩選。

4.3 免疫傳感器

免疫傳感器作為食品安全檢測技術(shù)具有精確度高、敏感性高、樣品前處理簡單、檢測迅速(每個樣品只需十幾秒至幾分鐘)、操作簡單、攜帶方便、高度自動化、可重復(fù)利用等優(yōu)點，減少了對使用者及環(huán)境、技術(shù)條件的依賴，適于現(xiàn)場或野外操作，正成為食品安全快速檢測研究的新熱點。近年來由于不合理和非法用藥導(dǎo)致獸藥殘留超標(biāo)引起的食物中毒事件屢有發(fā)生，對于獸藥殘留的檢測也越來越受到重視。Situ等[29]比較了免疫傳感器法和ELISA法測定豬膽汁中兩種磺胺藥物殘留的效果，并用HPLC法驗證。在測定的2081個樣品中，ELISA法測定磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶假陽性率為1.54%和1.44%，假陰性率為0.14%和0.24%；傳感器法的假陽性率分別為0.14%和0.34%，均無假陰性，可見免疫傳感器檢測結(jié)果更可靠。關(guān)于食品小分子污染物檢測免疫傳感器法的應(yīng)用已有不少，表1列舉了部分實例。

表1 免疫傳感器對食品中小分子污染物的檢測Table 1 Detection of small molecule contaminants in foodstuffs using immunosensors

微型化、集成化、智能化、多功能化是未來免疫傳感器的發(fā)展趨勢和重點方向，開發(fā)成本低、穩(wěn)定性高、高壽命的免疫傳感器是目前研究的熱點[36]。目前研究中，Knecht等[37]把10種抗生素的半抗原點樣法固定在硅烷化處理的載玻片上，形成半抗原陣列，進而把點好樣的載玻片固定到流通池中，通過陣列檢測器可同時檢測牛奶中的10種抗生素，實現(xiàn)多組分的同時檢測。Morais等[38]用CD/DVD檢測技術(shù)來檢測農(nóng)藥阿特拉嗪的殘留，檢測限為0.04μg/L。該研究為免疫傳感器的發(fā)展提供了新的方向，利用CD/DVD不僅可以同時對成千份樣品進行檢測，而且生產(chǎn)成本低廉，檢測高度自動化，可以視之為免疫檢測中的重大飛躍。隨著多學(xué)科的綜合發(fā)展，免疫傳感器將在食品安全檢測中有廣闊的應(yīng)用前景。

5 結(jié) 語

食品安全免疫學(xué)檢測具備上述一系列特點和優(yōu)勢，應(yīng)用越來越廣。當(dāng)前免疫學(xué)檢測不僅對檢測的靈敏性、方便性和經(jīng)濟性提出更高要求，而且對檢測的廣譜性、高通量性和在同一樣本中同時檢測不同半抗原提出了要求。筆者大膽推測，從技術(shù)進步角度講，對半抗原可控、可預(yù)測的抗原化設(shè)計以及所開發(fā)抗體結(jié)合新型免疫學(xué)檢測技術(shù)可以進一步降低成本，提高檢測效果與效率，滿足對樣品的高通量處理和實時對同一樣本的多種成分進行有效分析與檢測，將在今后食品安全檢測獲得進一步重視與突破。

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Research Progress of Applications of Hapten-based Immunoassay in the Detection of Food Safety

ZHANG Xiao-ying1，ZHAO Jin-zi1，CHEN Chen2，HAN Shui-zhong1，TIAN Ze-hua1
(1. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. Bio-resources Key Laboratory of Shaanxi Province, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China)

Immunoassay is one of the most important methods for the detection of food safety. This article reviews the design and synthesis of artificial antigens, the design of haptens, current problems of artificial antigens and applications of computation technology in hapten synthesis. Meanwhile, the applications of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, IgY antibodies, and genetically engineered antibodies in the detection of food safety are also discussed. Furthermore, comprehensive information on major immunological methods such as ELISA, gold-based colloidal immunochromatographic assay and immunosensor is also summarized. Hapten immunoassay methods for food safety detection have the advantages of low detection limit, fast detection, convenience and low cost. However, several key techniques including the predictable design of artificial antigens, the mass production of high-tittered antibodies and the combination with novel immunoassay methods for meeting the requirement of high-throughput screening and real-time multiple detection also need to be improved.

immunoassay；hapten；food safety

R392.11

A

1002-6630(2010)17-0397-05

2010-01-26

西北農(nóng)林科技大學(xué)引進人才啟動專項基金項目(01140407)；2009年度西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費青年項目(Z109021003)；西北農(nóng)林科技大學(xué)國家級動物科學(xué)實驗教學(xué)示范中心實驗室開放創(chuàng)新基金項目

張小鶯(1976—)，男，教授，博士，主要從事藥理學(xué)和抗體技術(shù)研究。E-mail：zhang.xy@nwsuaf.edu.cn