一株植物乳桿菌的分離鑒定及其隱蔽質粒的序列分析

都立輝，霍貴成*，鞠興榮，劉 芳

(1.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210003；2.東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150030；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014)

一株植物乳桿菌的分離鑒定及其隱蔽質粒的序列分析

都立輝1，霍貴成2,*，鞠興榮1，劉 芳3

(1.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210003；2.東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150030；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014)

從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離到1株乳酸桿菌，經(jīng)API 50 CH細菌鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因序列分析后鑒定為植物乳桿菌。分析該菌的質粒圖譜后發(fā)現(xiàn)該菌攜帶多個質粒，將其中的小質粒pLD1測序，結果顯示該質粒的大小為2112bp，堿基G+C含量為37.8%，只編碼1個復制蛋白，其中有1個17bp的序列重復了13次。BLAST發(fā)現(xiàn)該質粒同pLP2000等的同源性在95%以上，其中復制蛋白同其他質粒存在一些氨基酸差異。pLD1質粒序列的GenBank登陸號為NC_012220，并且它可用于構建良好的乳桿菌基因工程載體。

植物乳桿菌；隱蔽質粒；序列分析；復制蛋白

乳酸菌是公認安全的食品級微生物，具有許多的益生功能，在食品和醫(yī)藥領域的應用越來越廣泛[1-2]，并且某些乳酸菌還被用來外源表達一些功能物質。但是由于乳酸菌表達載體很少，尤其是具有特殊用途的表達載體更少，限制了乳酸菌生物工程的發(fā)展[3]。某些乳酸菌，如乳球菌、腸球菌、鏈球菌等都攜帶一些質粒[4]。這些質粒可能編碼一些重要的特性，例如噬菌體抗性、抗生素抗性、乳糖利用能力等。植物乳桿菌也可能攜帶一些質粒，但是由于對其研究較少，目前認為其中多數(shù)質粒還是隱蔽型質粒[5-6]，僅有很少一部分質粒已被測序，例如1個10877bp的pMD5057編碼有噬菌體抗性，1個2025bp的pLKS質粒編碼了四環(huán)素抗性等[7-8]。通過對菌株攜帶的質粒進行序列測定和功能分析，不僅能夠發(fā)現(xiàn)該質粒編碼的重要特性，也能為乳酸菌遺傳工程的發(fā)展提供重要的工具。

近幾年來，有關乳酸菌遺傳工具的研究越來越多，其目標是從基因水平上提高乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)性能。相對于乳酸乳球菌表達載體，乳桿菌的表達載體較少[9]。

由于分離自食品中的乳酸菌及其質粒是食品級的，不存在食品安全問題。因此，本研究擬對由傳統(tǒng)乳制品中分離到的1株植物乳桿菌KLDS1.0801中的小質粒pLD1進行全序列測定及功能分析，為構建具有自主知識產(chǎn)權的乳酸乳桿菌專用基因工程載體提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

大腸桿菌(E. coli DH5α)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei ATCC 7469)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus ATCC 4356) 本實驗室保藏菌種。

E. coli DH5α用LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)；乳桿菌用MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)，氨芐青霉素在大腸桿菌中使用的質量濃度為100μg/mL。

1.2 質粒、試劑與儀器

克隆載體pMD18-T、限制性核酸內切酶 寶生物工程(大連)有限公司；API 50 CH試劑條、API 50 CHL培養(yǎng)基 法國生物梅里埃公司；質粒小量提取試劑盒 天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒 上海華舜生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

9700 PCR System 美國ABI公司；UVP凝膠成像系統(tǒng) UVP公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實驗設備有限公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；搖床振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器有限公司。

1.3 乳酸菌的分離、純化和鑒定

將傳統(tǒng)乳制品在脫脂乳培養(yǎng)基中活化兩代，然后取1mL樣品，用滅菌生理鹽水經(jīng)適當梯度稀釋后涂布于含有3g/100mL CaCO3的MRS平板上，37℃培養(yǎng)24h，挑選出周圍形成透明圈的菌落，革蘭氏染色后鏡檢，將G+菌株繼續(xù)劃線于MRS平板，直至確定為純菌后保存。

參照文獻[10]，凡是革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶實驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌。在初步鑒定的基礎上，使用API 50 CH試劑條和API 50 CHL培養(yǎng)基對純化的乳酸菌進行鑒定，嚴格按照試劑條和培養(yǎng)基的使用說明書進行操作，使用L. casei ATCC7469和L. acidophilus ATCC 4356作為質控菌株。

1.4 16S rRNA基因序列的擴增和測序

乳酸菌基因組DNA的提取參照文獻[11]方法進行。16S rRNA基因序列的PCR擴增引物分別是上游引物(5′-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3′)和下游引物(5′-CTACGGCTACCTFGTFACGA-3′)[12]，引物合成和DNA序列測定由上海生物工程有限公司完成。PCR擴增產(chǎn)物連入克隆載體pMD18-T后轉化到大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆測序。

1.5 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

利用BLAST，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。然后從GenBank中提取乳酸桿菌屬內代表菌株的16S rRNA基因序列，與測定的序列共同用ClustalX1.83校準排齊進行多序列比較后，用MEGA 4軟件以Neighbor Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，1000次隨機抽樣，計算自引導值(Bootstrap)以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度[13]。

1.6 質粒的提取及其序列測定

植物乳桿菌KLDS 1.0801內源質粒的提取采用天根公司的質粒小量提取試劑盒進行，經(jīng)過以下修改：將菌體離心后重懸于含有30mg/mL溶菌酶的STE緩沖液(50mmol/L的Tris-HCl緩沖液，1mmol/L的EDTA，質量濃度為6.7g/100mL的蔗糖，pH8.0)中，37℃溫育20min，其余操作按照說明書進行。

回收其中的小質粒，選擇不同的酶，單酶酶切該質粒，分析其含有的酶切位點。以該質粒上只有1個酶切位點的酶酶切該質粒，回收酶切后的線性片段。借助于Taq酶的特性及PCR擴增原理補平酶切后的黏性末端并在3′末端引入堿基A，反應體系(總體積50μL)：40μL回收后的酶切片段，4μL dNTP，5μL 10×PCR Buffer，1μL Taq酶。將反應體系置于72℃保溫20min后回收DNA片段，同pMD18-T載體連接后熱轉化到大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆測序。借助于克隆載體的測序引物測定出部分序列，然后根據(jù)已測序列設計引物對插入的整個片段測序[14]。拼接各個測定序列獲得該質粒的全序列信息。

1.7 質粒的分析

利用NCBI等國際核苷酸、蛋白質數(shù)據(jù)庫以及DNAMAN等生物學軟件對質粒的核苷酸及氨基酸序列進行分析，并將該質粒全序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫。

2 結果與分析

2.1 乳酸乳桿菌的分離

從樣品中分離到1株乳酸桿菌，在MRS平板上培養(yǎng)24h后，菌落呈乳白色半透明，邊緣整齊；革蘭氏染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌呈革蘭氏陽性，細長桿狀，單生，將其命名為KLDS 1.0801。

2.2 ATB的鑒定結果

目測API試劑條的檢測結果，然后將檢測結果輸入電腦，使用ATB軟件對實驗結果進行判定。結果表明KLDS 1.0801為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，其中鑒定百分率(id%)為99.9%，模式頻率(T)為0.78。

2.3 16S rRNA基因的PCR擴增結果與系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴增得到的KLDS 1.0801菌株的16S rRNA基因序列為1529bp，該基因序列的GenBank注冊號為

FJ755813。將KLDS 1.0801的16S rRNA基因序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的乳桿菌屬內標準菌株進行多序列比較后繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列建立的乳桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Lactobacilli based on 16S rRNA gene sequence

由圖1可知，KLDS 1.0801同L. plantarum JCM 1149的親緣關系最近，序列相似性為99%。

2.4 質粒pLD1的提取和全序列測定

圖2 植物乳桿菌KLDS 1.0801內源性質粒圖譜Fig.2 Plasmid profile of L. plantarum KLDS 1.0801

由圖2可知，該菌株攜帶多個質粒，將其中的小質粒命名為pLD1?；厥召|粒pLD1，進行單酶酶切分析后發(fā)現(xiàn)SpeⅠ酶能夠酶切該質粒，并且只有1個酶切位點，結果見圖3。選取SpeⅠ酶切質粒pLD1，回收線性片段，末端補平后連入克隆載體。測序后發(fā)現(xiàn)該質粒大小為2112bp。質粒pLD1序列的GenBank注冊號為NC_012220。

圖3 質粒pLD1酶切分析Fig.3 Restriction enzyme analysis of pLD1

2.5 質粒的功能分析

質粒pLD1的G+C含量為37.8%。BLAST比對結果顯示：該質粒與質粒pLP2000(AY096004)和pLP1(M31223)等的同源性很高，相似度都在95%以上。通過ORF搜索，發(fā)現(xiàn)該質粒僅有1個編碼框，以SpeⅠ酶切位點為編號1，該編碼框的位置位于276到1232，共957bp，編碼1個318個氨基酸殘基的復制蛋白。如圖4所示，質粒pLD1同質粒pLP2000的復制蛋白在氨基酸水平上的同源性很高，只存在幾個氨基酸殘基的差異。該復制蛋白編碼了pfam01446保守結構域，屬于復制蛋白第一超家族，是滾環(huán)復制蛋白，因此質粒pLD1應該是滾環(huán)復制類型的。這一復制蛋白超家族廣泛分布在乳桿菌、葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌以及芽孢桿菌等眾多細菌種類中。通過重復序列檢索發(fā)現(xiàn)該質粒有13個重復序列，在1351到1587之間，有1個17bp的序列“CATTATCATGTAGTGCG”正向重復了13次，該重復序列可能和質粒的拷貝數(shù)有關。該質粒的復制起點在2084到2097之間，主要的酶切位點見圖5。

圖4 質粒pLD1和pLP2000的復制蛋白的氨基酸序列比較Fig.4 Alignment of amino acid sequences in replication proteins from pLD1 and pLP2000

圖5 質粒pLD1的酶切圖譜Fig.5 Restriction enzyme map of plasmid pLD1

3 討 論

乳酸桿菌是重要的工業(yè)微生物，該菌屬中大多數(shù)菌含有的質粒一般較少，迄今為止報道的只有17種(www. ncbi.nlm.nih.gov/genomes)，相對于研究比較成熟的含質粒種類較多的乳酸乳球菌，后者已經(jīng)出現(xiàn)了國際上廣泛應用的誘導型NICE表達系統(tǒng)[15]，乳酸桿菌可用的基因工程操作工具(如克隆載體、表達載體等)嚴重匱乏。這一狀況顯著制約了乳酸桿菌基因改造的實施。

通過對實驗室中保藏的乳酸桿菌進行篩查，在多個不同生境中分離得到的乳酸桿菌中都發(fā)現(xiàn)了相似大小的質粒，暗示該質?？赡艽嬖谟诓煌樗釛U菌中，這一發(fā)現(xiàn)表明該質粒的宿主范圍比較寬且可能在宿主中能較穩(wěn)定的存在。通過連續(xù)傳代50次后，提取質粒鑒定，質粒圖譜沒有變化，證實這一質粒能在乳酸桿菌中穩(wěn)定復制。

質粒序列的唯一性決定了質粒是一種不可多得的資源。20年來乳酸菌基因工程技術取得了重大進展，圍繞著乳酸菌和乳酸菌發(fā)酵食品的生物技術研究是當前歐洲和美國生物技術領域的重大研究課題。人們希望利用基因工程技術來極大地改良發(fā)酵劑的各種性能。因此，發(fā)現(xiàn)和利用具有特定功能的新質粒，對于乳酸菌的遺傳研究和構建具有自主知識產(chǎn)權的基因工程載體就顯得尤其重要[16-17]。本實驗中獲得的質粒來自于食品級的乳酸菌，且能在不同宿主中廣泛存在，質粒本身比較小，這些特性使得利用其構建適宜的基因工程載體成為可能。勿庸置疑，無論從食品加工的角度還是更有利于人類健康的方面來看，這些工具的存在都為發(fā)酵劑菌株遺傳性狀的改善提供了新的可能性。

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Isolation and Identification of a Lactobacillus plantarum Strain and Sequence Analysis of Its Cryptic Plasmid

DU Li-hui1，HUO Gui-cheng2,*，JU Xing-rong1，LIU Fang3
(1. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；3. Institute of
Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

A strain isolated from traditionally fermented dairy product was identified as Lactobacillus plantarum based on API 50 CH bacteria identification system and 16S rRNA sequence analysis. Plasmid profile indicated that this strain harbored several plasmids. A small plasmid designated as pLD1 was subjected to sequence analysis. This small plasmid had 2112 bp and G+C content of 37.8%. Meanwhile, a sequence with 17 bp was repeated 13 times in this small plasmid. BLAST results showed that pLD1 plasmid had more than 95% similarity with pLP2000 and that there was a difference in replication protein among this plasmid and others. The accession number of this small plasmid is NC_012220 and it is useful for the construction of genetically engineered vectors.

Lactobacillus plantarum；cryptic plasmid；sequence analysis；replication protein

Q93.331

A

1002-6630(2010)17-0236-04

2010-01-04

國家“863”計劃項目(2006AA10Z344)；南京財經(jīng)大學科研基金項目(C0837)

都立輝(1981—)，男，講師，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：dlhlh2000@yahoo.com.cn

*通信作者：霍貴成(1958—)，男，教授，博士，研究方向為乳品加工。E-mail：gchuo58@126.com