流式細(xì)胞術(shù)分析與評價(jià)酸奶菌種對模擬胃酸和膽汁鹽的耐受力

汪清美，陳慶森*

流式細(xì)胞術(shù)分析與評價(jià)酸奶菌種對模擬胃酸和膽汁鹽的耐受力

汪清美，陳慶森*

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

研究傳統(tǒng)酸奶菌種對人體胃酸和膽汁鹽的耐受性，對評價(jià)酸奶的益生性具有重要意義。實(shí)驗(yàn)選取普通酸奶中的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌作為研究對象，模擬胃腸環(huán)境以探討所選兩種菌株在不同pH值和不同質(zhì)量濃度脫膽鹽下的耐受力，用流式細(xì)胞儀(FCM)結(jié)合羧基熒光素二醋酸酯(5-(6)-carboxyfluorescein diacetate，5(6)-cFDA)和碘化丙錠(propidium iodide，PI)兩種熒光染料評價(jià)其活力。結(jié)果表明：pH2.0時(shí)，菌體細(xì)胞活性較低，其活細(xì)胞標(biāo)記率僅為41.8%，在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0時(shí)，活細(xì)胞標(biāo)記率越來越高，對其抑制性的影響逐漸減弱；在1g/100mL的脫膽鹽(DBS)中，活細(xì)胞標(biāo)記率為48.7%，而在0.5、0.25、0.1、0.05g/100mL的DBS中時(shí)，活細(xì)胞的標(biāo)記率越來越高；同時(shí)比較FCM與平板菌落計(jì)數(shù)法檢測菌體細(xì)胞的耐受水平。實(shí)驗(yàn)證實(shí)酸奶菌種能耐受pH值為5.0～7.0的胃酸和0.05～0.5g/100mL的DBS；FCM檢測的菌體細(xì)胞的狀況更能恰當(dāng)?shù)胤从嘲l(fā)酵酸奶品質(zhì)的優(yōu)劣。

酸奶菌種；pH值；脫膽鹽；胃酸；活細(xì)胞；標(biāo)記率

近幾年，隨著人們養(yǎng)生、健康、安全意識的逐漸增強(qiáng)，微生物功能制劑及功能食品市場十分活躍，品種也越來越多。但具有益生功能的微生物在人體內(nèi)的存活能力強(qiáng)弱直接關(guān)系到其對人體養(yǎng)生、健康促進(jìn)作用的正常發(fā)揮，也是檢驗(yàn)產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一。

在乳酸菌家族中，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus

b u l g a r i c u s)、嗜熱鏈球菌(S t r e p t o c o c c o u s thermophilus)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)等是重要的有益菌，具有維持宿主微生態(tài)平衡、抑制腸道病源菌生長、降低膽固醇及緩解乳糖不耐癥等作用[1-2]。早在20世紀(jì)初，俄國科學(xué)家伊里亞·梅契尼可夫就提出了保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcous thermophilus)的益生效果，盡管這些有益菌對人體健康的作用眾所周知，但是其在胃腸道內(nèi)的抗逆性較差，能否順利通過胃到達(dá)小腸，以及遠(yuǎn)端的結(jié)直腸，其對酸、膽汁鹽的耐受能力是一個(gè)關(guān)鍵因素。據(jù)報(bào)道[3]，胃液pH值因飲食結(jié)構(gòu)不同而波動(dòng)很大，通常pH值為3.0左右，空腹或食用酸性食品時(shí)pH值可達(dá)1.5，食用堿性食物pH值可達(dá)4.5，食物通過時(shí)間為1～2h。十二指腸中膽汁鹽含量為0.3～3g/kg，食物通過的時(shí)間相對極短，可見胃腸為高酸高膽汁鹽環(huán)境。Gilliland等[4]把0.3mg/mL膽汁酸鹽質(zhì)量濃度作為篩選耐膽汁酸鹽菌體的標(biāo)準(zhǔn)，Erkkia等[5]通過實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)論。

從概念上來說，菌的活性評價(jià)包括兩個(gè)指標(biāo)：繁殖力(reproductive capacity)和存活力(viability)。活菌能否定植并存活是活菌制劑發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵，這種定植存活過程取決于活菌能否抵御體內(nèi)的不良環(huán)境(低pH值和高膽汁酸鹽)及是否具有能附著于胃腸道的黏附能力，而前者又是前提[6]。傳統(tǒng)測定細(xì)菌耐酸耐膽鹽的方法是活菌計(jì)數(shù)法和濁度法，平板菌落計(jì)數(shù)法能直接說明哪些菌株具有可培養(yǎng)性，但那些“活的非可培養(yǎng)”細(xì)菌檢不出；濁度法檢測的是細(xì)菌繁殖的情況，但不能定量，這兩種傳統(tǒng)的方法不僅耗時(shí)，而且結(jié)果不夠精確。對菌體的活性評價(jià)和普通微生物分析一樣，也應(yīng)作為一個(gè)基本可靠的方法，并且這個(gè)方法必須快速精確，而流式細(xì)胞術(shù)(FCM)作為一門技術(shù)已成為檢測細(xì)菌活性快速而較好的方法。Diaper等[7]通過FCM結(jié)合cFDA成功地檢測了一系列具有脂酶活性的細(xì)菌培養(yǎng)液。酸奶菌種能否順利通過胃腸環(huán)境是決定其發(fā)揮功能特性的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)選取普通酸奶中兩種菌株(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌)作為研究對象，模擬人體胃腸環(huán)境，考察其在不同pH值和不同濃度脫膽鹽(deconjugated bile salts，DBS)的條件下這兩種菌株的耐受性，為人們評價(jià)酸奶對人體的益生作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

保加利亞乳桿菌1.1480(Lactobacillus bulgaricus 1.1480，L.b)、嗜熱鏈球菌6038(Streptococcus thermophilus6038，S.t)由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基。

1.2 試劑與儀器

羧基熒光素二醋酸酯(5(6)-cFDA) Invitrogen公司；碘化丙錠(PI) Sigma公司；0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(PBS)，pH值分別調(diào)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，用0.2μm的膜過濾，4℃保存待用；DBS(膽酸鈉和脫氧膽酸鈉按質(zhì)量比1:1配制)；二甲基亞砜(DMSO)等。

FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(雙激光配置) BD公司；ECLIPSE E200普通光學(xué)顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板；熒光顯微鏡 日本Nikon公司；3k15生化離心機(jī) Sigma公司；紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體細(xì)胞的獲取

L.b1.1480和S.t6038菌株于初始pH值為6.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中4 0℃發(fā)酵培養(yǎng)；作出生長曲線，取OD620nm=0.7的發(fā)酵液，4℃、4000×g離心10min，采用差速離心法，用PBS反復(fù)洗脫兩次，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌體細(xì)胞的前處理

1.3.2.1 對照組細(xì)胞樣品

一份200μL細(xì)胞樣品，于4℃冰箱保存待用作為對照組陽性管；另一份200μL細(xì)胞樣品，于70℃熱處理10min，在4℃冰箱保存待用作為對照組陰性管。陽性管和陰性管中的細(xì)胞樣品在上流式之前調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)/mL。

1.3.2.2 酸處理細(xì)胞樣品

取6等份200μL細(xì)胞樣品，分別用pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的PBS于37℃條件下孵育60min于4℃冰箱保存待用，上流式之前調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)/mL。

1.3.2.3 脫膽鹽處理細(xì)胞樣品

取5等份200μL細(xì)胞樣品，分別加到1.0、0.5、0.25、0.1、0.05g/100mL的DBS中，在37℃條件下孵育60min，于4℃冰箱保存待用，上流式之前調(diào)成菌體細(xì)胞濃度為1.0×106個(gè)/mL。

1.3.3 熒光標(biāo)記

1.3.3.15 (6)-cFDA單標(biāo)記菌體細(xì)胞

對1.3.2節(jié)處理的細(xì)胞樣品加20μL的cFDA，在暗室中操作，混合均勻后在避光的條件下3 0℃孵育10min，對cFDA標(biāo)記的細(xì)胞懸液4000×g離心10min，去上清，沉淀細(xì)胞用等體積的PBS重新懸均勻，于4℃條件下保存待測。

1.3.3.25 (6)-cFDA/PI雙標(biāo)記菌體細(xì)胞

將1.3.2節(jié)的細(xì)胞樣品加入20μL cFDA和15μL PI，整過操作過程在暗室中進(jìn)行，標(biāo)記好的細(xì)胞在避光條件

下30℃孵育10min，對cFDA標(biāo)記過的細(xì)胞4℃、4000×g離心10min，去上清，用等體積的PBS重新懸浮沉淀細(xì)胞，懸均勻，于4℃條件下保存待測。

1.3.4 FCM檢測細(xì)胞活性

將1.3.3節(jié)得到的細(xì)胞4℃恒溫保存上流式細(xì)胞儀檢測。在上流式細(xì)胞儀前，待測細(xì)胞樣品懸均勻。FCM檢測光源為氬離子激光，氬離子激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光光波長大于630nm，檢測器FL1檢測波長530nm，檢測器FL3檢測波長670nm，每個(gè)樣品收集3×104個(gè)細(xì)胞。以未進(jìn)行標(biāo)記的菌懸液為陰性對照，以前向散射角(FSC)和側(cè)向散射角(SSC)設(shè)“門”，圈定待檢測的目標(biāo)細(xì)胞；cFDA和PI這兩種熒光染料分別用來檢測活細(xì)胞和死細(xì)胞，cFDA走FL1熒光通道，而PI走FL3熒光通道，根據(jù)需要設(shè)定不同的參數(shù)組合。

1.3.5 平板菌落計(jì)數(shù)法

對1.3.2節(jié)處理得到的細(xì)胞樣品用無菌PBS進(jìn)行梯度稀釋，于MRS固體平板上37℃培養(yǎng)48h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并與FCM結(jié)果做比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用CELL Quest program 6.0和Origin6.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體細(xì)胞5(6)-cFDA單標(biāo)記和5(6)-cFDA/PI雙標(biāo)記對檢出效果的作用

2.1.15 (6)-cFDA單標(biāo)記菌體細(xì)胞對檢出效果的作用

圖1 5(6)-cFDA單標(biāo)記菌體細(xì)胞Fig.1 Cell suspensions stained with 5(6)-cFDA

在圖1A中，cFDA標(biāo)記的菌體細(xì)胞與自發(fā)熒光的細(xì)胞群在空間上分群不明顯，大部分自發(fā)熒光的細(xì)胞在陰性區(qū)；圖1B整個(gè)細(xì)胞群體成一體，待檢測的目標(biāo)細(xì)胞群與其他顆粒細(xì)胞不分群，在空間上無法準(zhǔn)確圈定目標(biāo)細(xì)胞來分析。圖1C與圖1B是同一細(xì)胞樣品，采用柱狀圖來分析，出現(xiàn)兩個(gè)峰，且峰圖較寬，致使cFDA標(biāo)記上的活細(xì)胞群與死細(xì)胞及其細(xì)胞顆粒分不開。由圖1可知，采用cFDA單標(biāo)記法在FCM圖中無法分開活細(xì)胞與死細(xì)胞群，因此，單標(biāo)記測定細(xì)胞活性無法得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.1.2 菌體細(xì)胞5(6)-cFDA/PI雙標(biāo)記對檢出效果的作用

圖2 5(6)-cFDA/PI雙標(biāo)記菌體細(xì)胞的結(jié)果Fig.2 Double labeling of cell suspensions stained with 5(6)-cFDA and PI

圖2A顯示菌體細(xì)胞暴露在pH2.0的PBS液中，41.2%的菌體細(xì)胞死亡，相應(yīng)地被cFDA標(biāo)記上的活細(xì)胞為59.8%；圖2B中，PI和cFDA標(biāo)上的死細(xì)胞和活細(xì)胞在空間上能明顯地分開，通過圈圖統(tǒng)計(jì)分析可得出被PI和cFDA標(biāo)記上的死細(xì)胞和活細(xì)胞率；圖2C中，在pH7.0時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞被cFDA標(biāo)記上，一些自發(fā)熒光的細(xì)胞在空間也可區(qū)分。所以，雙標(biāo)記法在流式圖中更易區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞群體，而且標(biāo)記的結(jié)果更精確。

2.2 模擬胃腸環(huán)境評價(jià)傳統(tǒng)菌種細(xì)胞的生存力

2.2.1 酸處理對菌體細(xì)胞活性的影響

按照1.3.3.2節(jié)標(biāo)記細(xì)胞的方式分析檢測傳統(tǒng)酸奶中菌種細(xì)胞對胃酸的耐受性，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH值的酸處理對菌體細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of pH on viability of suspended cells

由圖3可知，菌體細(xì)胞在pH2.0的PBS中孵育60min后，菌體細(xì)胞耐受性較低，活細(xì)胞被cFDA標(biāo)記且標(biāo)記率為41.8%，在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，對菌株細(xì)胞的抑制力越來越低，相應(yīng)地活細(xì)胞的標(biāo)記率隨pH值的增大而增高，其活菌數(shù)不斷上升，菌株呈正常生長態(tài)勢，且在整個(gè)處理期間，活菌數(shù)變化不大，說明pH值在5.0～7.0內(nèi)對菌體細(xì)胞的存活抑制較小。

2.2.2 脫膽鹽處理對菌體細(xì)胞活性的影響

小腸中膽汁鹽對菌體細(xì)胞有較大的影響，按照1.3.3.2節(jié)的方式模擬人體胃腸環(huán)境標(biāo)記菌體細(xì)胞，檢測其對不同終質(zhì)量濃度脫膽鹽的耐受性，結(jié)果見圖4。

圖4 不同終質(zhì)量濃度的脫膽鹽對菌體細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of deconjugated bile salt concentration on viability of suspended cells

由圖4可知，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這兩種菌的菌體細(xì)胞暴露在0、0.05、0.1、0.25、0.5g/100mL的DBS下，菌體細(xì)胞活性發(fā)生不同程度的變化。圖4A為保加利亞乳桿菌菌體細(xì)胞在不加DBS的情況下，99.1%的菌體細(xì)胞被cFDA標(biāo)記，隨著DBS在菌體細(xì)胞中終質(zhì)量濃度的增加，標(biāo)記率越來越低。0.05g/100mL的DBS對乳酸菌菌體細(xì)胞無明顯抑制作用，隨著膽酸鹽質(zhì)量濃度的提高，對乳酸菌的抑制作用逐步加強(qiáng)。當(dāng)菌體細(xì)胞在0.5g/100mL的DBS中，部分菌體細(xì)胞表現(xiàn)無活性，相應(yīng)地平板上的菌體細(xì)胞生長都很微弱。1g/100mL的DBS對這兩株菌種細(xì)胞表現(xiàn)明顯的抑制作用(圖4未顯示)。顧瑞霞等[8]研究的結(jié)果是保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌能耐受0.2～0.7g/100mL的DBS，本研究結(jié)果與此基本相一致。

圖4F～J為菌體細(xì)胞暴露在0、0.05、0.1、0.25、0.5g/100mL的DBS后被PI標(biāo)記的結(jié)果，其結(jié)果與cFDA標(biāo)記的結(jié)果相對應(yīng)。

2.3 發(fā)酵酸乳菌種基于FCM和平板菌落計(jì)數(shù)法檢測效果的比較

傳統(tǒng)檢測菌體細(xì)胞活性的方法是平板菌落計(jì)數(shù)法和濁度法等，但這些方法既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，且結(jié)果不精確。比較FCM和平板菌落計(jì)數(shù)法對酸乳菌種活性的檢測效果，其結(jié)果見圖5。

圖5為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在不同質(zhì)量濃度的脫膽鹽中孵育后于MRS固體平板上培養(yǎng)，其計(jì)數(shù)結(jié)果與FCM-cFDA/PI標(biāo)記結(jié)果的比較，cFDA/PI標(biāo)記的結(jié)果略高于平板計(jì)數(shù)結(jié)果；同樣，在不同pH值下的菌體細(xì)胞，F(xiàn)CM計(jì)數(shù)的結(jié)果高于平板菌落計(jì)數(shù)法(結(jié)果未顯示)。與傳統(tǒng)方法相比，F(xiàn)CM方法檢測傳統(tǒng)酸乳菌種活性有諸多優(yōu)勢。平板菌落計(jì)數(shù)法耗時(shí)長(通常需要48h)，數(shù)據(jù)離散程度高。在本研究中發(fā)現(xiàn)，同時(shí)使用平板菌落計(jì)數(shù)法和FCM方法檢測同樣的菌液細(xì)胞，因

細(xì)菌在平板上生長過程中易受許多外界因素影響，有時(shí)并不能準(zhǔn)確地反映菌液中活菌數(shù)的比例關(guān)系。與之相比，F(xiàn)CM方法取樣和染色操作簡便、耗時(shí)短，完成整個(gè)檢測過程僅需1h左后即可獲得準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)。

圖5 FCM和平板菌落計(jì)數(shù)法檢測酸乳菌種對脫膽鹽的耐受性的比較Fig. 5 Comparison of tolerance of yogurt strains to bile salt evaluated by flow cytometry and plate counts

3 討 論

羧基熒光素二醋酸酯(5-(6)-carboxyfluorescein diacetate，5(6)-cFDA)是一種具有酯酶熒光底物的染料，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的活性分析中。5(6)-cFDA具有細(xì)胞滲透性，通過胞內(nèi)非特異性脂酶水解二醋酸鹽(DA)生成羧基熒光素(fluorescent carboxyfluorescein，cF)[9]，在藍(lán)色光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。部分菌體細(xì)胞自身在激光激發(fā)下，能發(fā)出較弱的自發(fā)熒光，自發(fā)熒光在波長530nm左右被FL1檢測器檢測；被5(6)-cFDA染色的活細(xì)胞在530nm波長附近發(fā)出很強(qiáng)的綠色熒光，但死細(xì)胞因不能被5(6)-cFDA標(biāo)記故不能被檢測出，通過在FCM圖譜上比較熒光強(qiáng)度的差異，就可以將活細(xì)胞與死細(xì)胞區(qū)分開來，但問題是菌體細(xì)胞的自發(fā)熒光在波長530nm左右也被檢出，所以，cFDA單標(biāo)記易造成假陽性結(jié)果。

cFDA/PI這兩種熒光染料結(jié)合FCM來檢測菌體細(xì)胞的存活力之所以應(yīng)用廣泛，是因?yàn)樗袠?biāo)記上的細(xì)胞群在空間上易區(qū)分。在流式的FL1-H/FL3-H的散點(diǎn)圖中，因cFDA和PI的激發(fā)光譜不同，cFDA和PI標(biāo)記的細(xì)胞亞群能在空間分開；在直方圖中，當(dāng)未被標(biāo)記上的細(xì)胞或一些自發(fā)熒光的細(xì)胞與cFDA/PI標(biāo)記上的細(xì)胞在峰圖中有較高的重疊時(shí)，通過圈定散點(diǎn)圖中的活/死細(xì)胞群，在直方中得到較好的圖譜。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，菌種細(xì)胞在pH值為2.0的PBS中孵育后，對菌體細(xì)胞活性有明顯的抑制，F(xiàn)CM圖譜中標(biāo)記率只有59.12%，在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0時(shí)抑制率明顯下降，并且在6.0、7.0時(shí)抑制率幾乎為零，在pH7.0時(shí)和對照組幾乎無差別，說明大部分菌體細(xì)胞能耐受pH值為5.0～7.0的環(huán)境。DBS在0.05～0.5g/100mL時(shí)菌體細(xì)胞的活性表現(xiàn)較高，而在1g/100mL的脫膽鹽條件下，標(biāo)記率只有不到30%，說明1g/100mL的脫膽鹽明顯抑制了細(xì)胞的活性。通過酸奶菌種對酸、脫膽鹽耐受性的研究，發(fā)現(xiàn)在pH值在5.0～7.0、脫膽鹽在0～0.5g/100mL內(nèi)，酸奶菌種細(xì)胞活性受抑制較小。實(shí)驗(yàn)過程還發(fā)現(xiàn)菌體細(xì)胞濃度在104～106個(gè)/mL范圍內(nèi)，在FCM的檢測中能將活性細(xì)胞和無活性細(xì)胞清楚地分開，并能正確反映其比例關(guān)系。

通過酸奶菌種對模擬胃酸和膽汁鹽的耐受力的分析，可以得出傳統(tǒng)酸奶菌種在食入人體胃腸后對胃酸和膽汁鹽的耐受力并不是很高，李偉等[10]曾較全面地介紹了酸奶的演變過程以及在發(fā)酵食品中的重要地位，因此，提高發(fā)酵酸乳中有益菌在腸道中的活性以及活性分析、穩(wěn)定性的鑒定至關(guān)重要。

[1]FULLER R. Probiotics in man and animals[J]. J Appl Bacteriol, 1989, 66(5): 365-378.

[2]RASIC J L. The role of dairy foods containing bifidobacteria and acidophilus bacteria in nutrition and health[J]. North Eur Dairy, 1983, 4(1): 23-25.

[3]HUNGER W, PEITERSEN N. New technical aspects of the preparation of starter culture[J]. Bulletin IDF, 1992, 277: 17-21.

[4]GILLILAND S E, STALEY T, BUSH L J. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as dietary adjunct[J]. Journal of Dairy Science, 1984, 67(12): 3045-3051.

[5]ERKKIA S, PETAJA E. Screening of commercial meat starter cultures at low pH and in the presence of bile salts for potential probiotic use[J]. Meat Science, 2000, 55(3): 297-300.

[6]YOUNG K S. Internet addiction: the emergence of a new clinical disorder [J]. Cyber Psychology and Behavior, 1996, 1(3): 237-244.

[7]DIAPER J P, EDWARDS C. The use of fluorogenic esters to detect viable bacteria by flow cytometry[J]. Journal of Applied Mirobiology, 1994, 77(2): 221-228.

[8]顧瑞霞, 譚東興, 郭久和, 等. 膽汁酸鹽和低pH值對乳酸菌活性的影響[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1996, 23(3): 144-146.

[9]HOEFEL D, GROOBY W L, MONIS P T, et al. A comparative study of carboxyfluorescein diacetate and carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester as indicators of bacterial activity[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 52(3): 379-388.

[10]李偉, 陳慶森. 腸道黏膜免疫屏障及其菌群與機(jī)體健康關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 649-655.

Tolerability of Yogurt Strains to Mimic Gastric Acid and Bile Salt as Analyzed by Flow Cytometry

WANG Qing-mei，CHEN Qing-sen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Studies on the tolerability of traditional yogurt strains to gastric acid and bile salt are very important to evaluate probiotic strains in yogurt. The Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus in yogurt were evaluated for their tolerance to different pH and different concentrations of bile salt in mimic gastrointestinal environment using flow cytometry (FCM) combined with double-fluorescence dye staining by 5(6)-cFDA and PI. The cell viability was very small, and the percentage of labeled viable cells was only 41.8% at an exposure pH of 2.0 and became higher and higher as the exposure pH increased from 3.0 to 7.0 (3.0, 4.0 through 7.0), and the inhibitory effect on viable cells showed a progressive reduction. The percentage of labeled viable cells exposed to 1 g/100mL deconjugated bile salt (DBS) was 48.7%, and those of labeled viable cells exposed to 0.5 g/100mL, 0.25 g/100mL, 0.1 g/100mL and 0.05 g/100mL DBS displayed an increasing pattern. Flow cytometry and plate counts were comparatively used to determine cell viability. The above two species of strains exhibited strong tolerance at the conditions of pH 5.0－7.0 gastric acid and 0.05－0.5 g/100mL deconjugated bile salt. Flow cytometry count was superior to plate count.

yogurt strain；pH；deconjugated bile salt；gastric acid；living cell；percentage of labeled cells

R446.61

A

1002-6630(2010)21-0384-06

2010-07-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771524)

汪清美(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)。E-mail：wanghan812819@163.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn