薄層層析-生物自顯影法篩選油菜蜂花粉中活性成分

孫麗萍，杜 夏，徐 響，董 捷，安仲姚，楊佳林

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心蜂產(chǎn)品分中心，北京 100093)

薄層層析-生物自顯影法篩選油菜蜂花粉中活性成分

孫麗萍1,2，杜 夏1，徐 響1,2，董 捷1,2，安仲姚1，楊佳林1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心蜂產(chǎn)品分中心，北京 100093)

采用薄層層析-生物自顯影法篩選油菜蜂花粉中清除DPPH自由基的活性成分和抑菌活性成分。結(jié)果顯示：油菜蜂花粉中清除DPPH自由基的黃酮類活性成分主要以苷的形式存在，酸解后生成了包括槲皮素和山奈酚在內(nèi)的多種抗氧化成分；在Rf值0.29和0.86處存在抑菌活性成分，不同顯色方法確認(rèn)，抑菌活性成分的種類可能包括酚類、鞣質(zhì)、黃酮類或皂苷類。

油菜蜂花粉；薄層層析-生物自顯影；抗氧化活性；抑菌活性

Abstract：TLC-bioautography was used to screen the DPPH radical scavengers and the antibacterial ingredients in rape bee pollen. The experimental results indicated the flavonoids as DPPH radical scavengers mainly existed in form of glycosides in rape bee pollen, and the acidicly hydrolyzed ethanol extract from rape bee pollen contained a variety of antioxidant compounds including quercetin and kaempferol. There were two small molecules with Rf values of 0.29 and 0.86 found to have antibacterial activity in the water extract from rape bee pollen. According to the results of color development reaction, the types of antibacterial components were polyphenols, tannin, flavonoids or saponins, etc.

Key words：rape bee pollen；TLC-bioautography；antioxidant activity；antibacterial activity

蜂花粉是自然界存在的營養(yǎng)最豐富的一種純天然食品，含有蛋白質(zhì)、酶類、不飽和脂肪酸、碳水化合物、酚類、黃酮類物質(zhì)、磷脂、各種維生素和微量元素，蜂花粉被稱為“天然微型營養(yǎng)庫”[1]。蜂花粉中含有豐富的活性物質(zhì)能被人體直接吸收利用，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、軟化心腦血管、延緩衰老、提高免疫功能、增強(qiáng)體力等功能，是一種藥食同源食品[2]。研究表明油菜蜂花粉不但具有抗炎[3]、保護(hù)肝臟[4]、調(diào)節(jié)免疫[5]功能，還有抑菌[6]和抗氧化[7]功能。

薄層層析(TLC)是一種快速分離和鑒定混合物成分的方法，而薄層層析-生物自顯影法(TLC-Bioautography)是近年來應(yīng)用的一種將薄層層析和生物活性測定相結(jié)合的抗菌活性物質(zhì)檢測方法[8-11]。利用薄層色譜的分離能力將實(shí)驗樣品在薄層板上通過展開劑展開后，使薄層板與含有供試微生物的培養(yǎng)基相接觸，在一定條件下培養(yǎng)一段時間后，非活性部位會被生長出的供試微生物所覆蓋而呈現(xiàn)背景色；活性部位由于抗菌成分的存在，指示微生物的生長受到抑制而呈現(xiàn)抑菌斑點(diǎn)，這樣就可以初步了解混合物抗菌活性成分的相對極性，為活性單體化合物的分離提供依據(jù)。TLC-DPPH是薄層層析-生物自顯影法的一種，樣品展開后使薄層板與DPPH相接觸，具有清除DPPH自由基能力的物質(zhì)能使DPPH還原成DPPH-H而呈現(xiàn)黃色，薄層板本身顯紫色，從而篩選出活性組分[12]。薄層層析-生物自顯影法具有簡單、快捷、直觀的特點(diǎn)，用以評價植物中生物活性物質(zhì)的抗氧化能力及抑菌性[13-14]，在蜂花粉抗氧化和抑菌活性成分研究中應(yīng)用較少。本實(shí)驗采用薄層層析-生物自顯影法篩選油菜蜂花粉中抗氧化及抑菌活性成分，研究蜂花粉抗氧化活性和抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為蜂花粉功效研究提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油菜蜂花粉：產(chǎn)地：甘肅天水市，－20℃保藏。

DPPH、槲皮素、山奈酚、異鼠李素、柚皮素Sigma公司；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CICC編號10201) 中國微生物菌種保藏中心；LB瓊脂培養(yǎng)基 北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；硅膠G板 煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所；所用試劑均為分析純。

AL204電子天平 梅特勒-托利多(上海)公司；SWGJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 抗氧化活性組分篩選

1.2.1 樣品制備

稱取一定量破壁油菜蜂花粉[15]，加入10倍體積80%乙醇，超聲提取兩次，各1h，離心后合并上清，真空濃縮至干，記為乙醇提取物，備用；另取5.080g乙醇提取物，加入體積分?jǐn)?shù)為25%鹽酸溶液5mL，甲醇30mL，90℃回流1.5h，甲醇定容到100mL，記為酸解物，備用。

1.2.2 TLC-DPPH方法

取質(zhì)量濃度為120μg/mL的槲皮素、山奈酚、異鼠李素、柚皮素各5μL，質(zhì)量濃度為1mg/mL酸解物、醇提物各5μL，硅膠G板(10cm×10cm)點(diǎn)樣，以苯、乙酸乙酯、甲酸體積比5:4:1為展開劑，展距8cm，展開后晾干，噴以0.04mg/mL的DPPH甲醇溶液，晾干觀察。

1.3 抑菌活性組分篩選

1.3.1 樣品制備

取適量破壁油菜蜂花粉[15]，加入5倍體積蒸餾水超聲提取兩次，各1h，合并上清液，減壓濃縮后添加5倍體積無水乙醇，離心取上清液減壓濃縮至干，備用。

1.3.2 TLC-自顯影方法

花粉樣品以乙酸乙酯、水、甲酸、乙酸體積比70:30:3:2為展開劑展開4份，其中一份噴施以0.04% DPPH溶液顯色，另外3份利用生物自顯影技術(shù)進(jìn)行抑菌效果判定。取已進(jìn)行金黃色葡萄球菌菌液涂布并干燥透的平皿，分別將已揮干溶劑并切為兩部分的硅膠板平穩(wěn)放置在瓊脂表面(盡量避免產(chǎn)生氣泡)，壓實(shí)，一段時間后輕輕取下硅膠板，平皿37℃培養(yǎng)24h，以無細(xì)菌生長或細(xì)菌生長較少部位的Rf值判定有效抑菌成分所在。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性成分TLC-DPPH分析

以4種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品(槲皮素、山奈酚、異鼠李素、柚皮素)和花粉醇提物酸解前后的樣品進(jìn)行TLC-DPPH實(shí)驗，結(jié)果見圖1。

圖1 各樣品對DPPH自由基清除作用的TLC圖Fig.1 TLC-DPPH profiles of ethanol extract from rape bee pollen before and after acidic hydrolysis

如圖1所示，槲皮素、山奈酚、異鼠李素和柚皮素具有不同程度的DPPH自由基清除活性，在相同質(zhì)量濃度(120μg/mL)下，異鼠李素和柚皮素的斑點(diǎn)小而且暗，而槲皮素和山奈酚的斑點(diǎn)大而黃，說明槲皮素和山奈酚的DPPH清除效果要明顯強(qiáng)于異鼠李素和柚皮素，斑點(diǎn)面積和明亮程度由大到小依次為槲皮素、山奈酚、柚皮素和異鼠李素，說明對于DPPH自由基的清除能力槲皮素＞山奈酚＞柚皮素＞異鼠李素。

酸解樣品在Rf為0.6和0.74處有黃色斑點(diǎn)，與槲皮素和山奈酚、異鼠李素的Rf值相同，醇提樣品在該位置不存在斑點(diǎn)，經(jīng)HPLC檢測Rf 0.74斑點(diǎn)的UV特征與山奈酚相同，說明油菜蜂花粉中存在以槲皮素和山奈酚為苷元的黃酮醇苷，經(jīng)過水解后生成了槲皮素和山奈酚；而油菜蜂花粉中游離苷元的含量很少，在薄層板上無明顯斑點(diǎn)。醇提物酸解前在Rf為0.26處有黃色斑點(diǎn)，酸解后消失，說明酸解后此物質(zhì)完全分解，該成分鑒定工作正在進(jìn)行中。醇提物Rf 值在0.2至0.8之間只有一個黃色斑點(diǎn)(Rf 0.26)，而酸解物有7個黃色斑點(diǎn)，說明花粉酸解后產(chǎn)生了更多種類的抗氧化成分。

2.2 抑菌活性成分TLC-生物自顯影分析

將花粉水提醇沉組分進(jìn)行TLC后貼板進(jìn)行抑菌實(shí)驗，結(jié)果見圖2。

圖2 TLC-生物自顯影抑菌效果Fig.2 TLC-bioautography examination of fractions of water extract from rape bee pollen

TLC-自顯影實(shí)驗中，對硅膠板的貼板時間進(jìn)行了考察，分別進(jìn)行了貼板1、2、3h的預(yù)實(shí)驗，實(shí)驗結(jié)果顯示，貼板1h抑菌物質(zhì)無法完全擴(kuò)散到瓊脂中，生物自顯影效果不明顯，貼板2h和3h效果比較理想，所以實(shí)驗時選擇貼板2h。

如圖2所示，薄層板與含有金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基相接觸，在37℃培養(yǎng)24h后，非活性部位會被生長出的金黃色葡萄球菌所覆蓋而呈現(xiàn)背景色，活性部位(Rf為0.86和0.29處)由于抑菌成分的存在，金黃色葡萄球菌生長受到抑制而呈現(xiàn)抑菌斑點(diǎn)；花粉樣品出現(xiàn)2個抑菌斑點(diǎn)，說明花粉中存在不止一種的抑菌活性成分；Rf 0.86的抑菌斑點(diǎn)大于Rf 0.29的抑菌斑點(diǎn)，說明該成分(Rf 0.86)的抑菌能力較強(qiáng)或是含量較大。經(jīng)TLC-DPPH驗證，Rf為0.86和0.29的兩個抑菌斑點(diǎn)具有清除DPPH自由基的能力，說明兩斑點(diǎn)成分具有抑菌和抗氧化雙重活性。

經(jīng)TLC不同顯色方法確認(rèn)，抑菌活性成分(Rf 0.86和Rf 0.29)對質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% FeCl3、2% FeCl3-鐵氰化鉀、1% AlCl3和5% 磷鉬酸顯色劑呈陽性反應(yīng)，說明抑菌活性成分可能是鞣質(zhì)、酚類、黃酮類或皂苷類成分，分離鑒定工作正在進(jìn)行中。

3 結(jié) 論

本研究將薄層層析-生物自顯影法引入蜂花粉抗氧化活性和抑菌性研究中，采用TLC-DPPH法對油菜蜂花粉乙醇提取物及酸解物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，油菜蜂花粉中存在以槲皮素和山奈酚為苷元的黃酮醇苷，酸解后生成了槲皮素和山奈酚。DPPH自由基的清除能力槲皮素＞山奈酚＞柚皮素＞異鼠李素；用TLC-生物自顯影技術(shù)篩選油菜蜂花粉抑菌活性組分，結(jié)果顯示花粉水提醇沉部位存在兩種抑菌成分，其Rf值為0.29和0.86，TLC-DPPH顯示這兩種成分還具有清除DPPH自由基的能力。實(shí)驗證實(shí)薄層層析-生物自顯影法能夠簡單、快捷、直觀地顯示出油菜蜂花粉中抗氧化及抑菌活性成分的相對極性，為活性單體化合物的分離提供依據(jù)。

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Using TLC-bioautography to Screen Active Compounds in Rape Bee Pollen

SUN Li-ping1,2，DU Xia1，XU Xiang1,2，DONG Jie1,2，AN Zhong-yao1，YANG Jia-lin1
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Bee Product Center, National R&D Center for Agro-Food Processing, Beijing 100093, China)

S896.4

A

1002-6630(2010)21-0069-03

2010-08-02

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(nyhyzx07-041)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(NYCYTX-43)；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2009GB23260456)

孫麗萍(1963—)，女，研究員，碩士，研究方向為蜂產(chǎn)品功能因子的分離純化。E-mail：caasun@126.com