泥鰍肉酶解物對(duì)羥自由基的清除作用

姚東瑞，王淑軍，李圓圓，盤賽昆，楊 帆,2

(1.淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116000)

泥鰍肉酶解物對(duì)羥自由基的清除作用

姚東瑞1，王淑軍1，李圓圓1，盤賽昆1，楊 帆1,2

(1.淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116000)

為了探討深度開發(fā)泥鰍蛋白制備功能性肽的可能性，采用比色法研究泥鰍肉酶解物對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基的清除效果，從復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶5種酶中，篩選出菠蘿蛋白酶作為酶解泥鰍肉制備具有清除羥自由基活性酶解物的適宜水解酶。用響應(yīng)面分析法(RSM)對(duì)該酶的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用Sephadex G-15凝膠層析測(cè)定最佳酶解條件下制得的酶解液中活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布。結(jié)果表明，菠蘿蛋白酶的最佳酶解條件為：固液比1:4、加酶量0.2%、pH6.47、溫度54.48℃、酶解時(shí)間59.97min，酶解物對(duì)羥自由基的清除率為99.03 %，IC50值為0.57mg/mL。酶解液中活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量范圍為1129～2344。

泥鰍肉；酶解物；羥自由基

Abstract：In order to obtain bioactive peptides having better ability to scavenge hydroxyl free radicals generated in Fenton system,the muscle of loach (Misgurnus anguillicaudatus) was hydrolyzed separately with flavourzyme, protamex, trypsin and pepsin and bromelain, and bromelain was the selected protease for the hydrolysis of loach muscle. The subsequent investigations involved optimization of the hydrolysis of loach muscle by response surface methodology for achieving maximum hydroxyl free radical scavenging rate and Sephadex G-15 gel column chromatographic determination of relative molecular mass distribution of the hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions. The optimal conditions for bromelain-catalyzed hydrolysis of loach muscle were determined as follows:solid/liquid ratio, 1:4; enzyme dose, 0.2%; pH, 6.47; hydrolysis temperature, 54.48 ℃; and hydrolysis duration, 59.97 ℃. The hydrolysate obtained under these conditions displayed a free radical scavenging rate of 99.03%and an IC50 value of 0.57 mg/mL, and contained peptides having a relative molecular mass varying from 1129 to 2344.

Key words：loach (Misgurnus anguillicaudatus)；enzymatic hydrolysis；hydroxyl free radical

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)是滋補(bǔ)佳品，素有“水中人參”的美譽(yù)。其肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，含有多種對(duì)人體有益的生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、賴氨酸等必需氨基酸、類胡蘿卜素、尼克酸等維生素以及鋅、硒等微量元素[1]。它們具有提高機(jī)體免疫活性的作用，對(duì)于人類防病治病、強(qiáng)身健體、延年益壽大有裨益，因此研究泥鰍肉中的活性成分具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。近10多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)泥鰍中生物活性成分如凝集素[2]、泥鰍素(misgurin)[3]、超氧化物歧化酶[4]、泥鰍多糖[5]、牛磺酸[5]和透明質(zhì)酸[6]的研究報(bào)道較多，但對(duì)泥鰍肉酶解物對(duì)羥自由基(·OH)清除作用的研究尚未見報(bào)道。

20世紀(jì)50年代中期Harman首先提出衰老自由基學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為自由基攻擊生命大分子造成組織損傷，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤的惡性疾病的重大原因[7]，其中·OH是一種氧化能力很強(qiáng)的自由基，是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基[8]。

生物活性肽易被人體消化吸收，同時(shí)具有抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)激素和降血壓等功能?？寡趸嚯氖巧锘钚噪牡囊环N，它具有通過(guò)減少氧自由基和羥自由基從而達(dá)到抗衰老的功能，因此含有生物活性肽的各種保健食品的開發(fā)具有廣闊的市場(chǎng)前景。本實(shí)驗(yàn)采用Fenton體系測(cè)定泥鰍肉酶解物對(duì)·OH的清除作用，旨在為利用泥鰍肉蛋白制備抗氧化活性肽提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活泥鰍購(gòu)于連云港敦尚鎮(zhèn)泥鰍養(yǎng)殖基地，經(jīng)淮海工學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖系程漢良教授鑒定為泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)，去頭、尾和血并洗凈，置于－40℃冰箱中冷凍備用。

復(fù)合蛋白酶(42300U/g)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(31800 U/g)諾維信(沈陽(yáng))公司；菠蘿蛋白酶(43600U/g)、胰蛋白酶(41000U/g)、胃蛋白酶(28000U/g) 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；α-脫氧核糖(2-Deoxy-D-ribose)、硫代巴比妥酸(TBA) 生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS323S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DKZ-3型電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科技有限公司；日立CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本Hitach公司；SynergyTM HT型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司；BioLogic DuoFlowTM層析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝流程

鮮活泥鰍→預(yù)處理→冷凍備用→解凍→加水?dāng)嚧蚓鶆颉附狻鷾缑?沸水浴，10min)→冷卻→10000r/min離心20min→收集上清液

1.3.2 酶活力測(cè)定

采用Folin-酚法，以酪蛋白為底物，參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》[9]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 水解度測(cè)定

式中：CN為水解液中游離氨基氮的含量/(g/100mL)；CN0為魚糜液水解前游離氨基氮的含量/(g/100mL)；C為魚糜液中蛋白氮的含量/(g/100mL)。

游離氨基氮采用甲醛電位滴定法測(cè)定[10]，蛋白氮采用微量凱氏定氮法測(cè)定[11]。

1.3.4 對(duì)羥自由基清除作用實(shí)驗(yàn)

[12-13]測(cè)定泥鰍肉酶解物對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基清除率。IC50定義為清除50%羥自由基時(shí)的多肽質(zhì)量濃度(mg/mL)，用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件的概率單位法(probit)計(jì)算。多肽含量測(cè)定采用Lowry法[14]。

1.3.5 酶的篩選

取泥鰍肉10g，加水30mL，以0.29%加酶量(m酶/m泥)分別加入菠蘿蛋白酶(pH 7.0，50℃)、復(fù)合蛋白酶(pH7.0，50℃)、胰蛋白酶(pH8.0，55℃)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(pH7.0，50℃)和胃蛋白酶(pH2.0，37℃)，再分別在上述酶的適宜pH值和溫度下進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，以IC50及水解度為指標(biāo)考察0～240min內(nèi)(間隔30min)供試酶酶解液對(duì)羥自由基的清除效果及水解進(jìn)程。

1.3.6 泥鰍肉酶解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

酶解物相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定采用凝膠層析法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

圖1 5種供試酶對(duì)泥鰍肉的水解進(jìn)程Fig.1 Hydrolysis courses of loach muscle with five proteases

圖2 不同蛋白酶酶解物對(duì)清除羥自由基的影響Fig.2 Change in IC50of loach muscle hydrolysate during hydrolysis with five proteases

如圖1所示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，不同蛋白酶作用下的水解度逐漸增加，但增加趨勢(shì)變緩和。圖2顯示，未經(jīng)酶解的泥鰍肉勻漿具有一定清除羥自由基的能力，其清除率達(dá)45.7%，IC50為2.32mg/mL。除了胰蛋白酶外，供試的4種酶酶解物對(duì)羥自由基的清除能力均較未經(jīng)酶解的勻漿有顯著提高，但不同蛋白酶酶解物的清除作用存在一定差異，沒有一定的規(guī)律性，并且水解度和清除率之間沒有相關(guān)性，因此酶的選擇及工藝條件的優(yōu)化在制備功能肽時(shí)是非常必要的。菠蘿蛋白酶和胃蛋白酶酶解物對(duì)羥自由基清除活性較高，但菠蘿蛋白酶能在較短的時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到較好的效果，而胃蛋白酶達(dá)到相當(dāng)?shù)男Ч麆t需要較長(zhǎng)的水解時(shí)間，因此選用菠蘿蛋白酶用于下一階段的研究。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 固液比對(duì)酶解物清除羥自由基的影響

選取固液比1:3、1:4、1:5、1:6，調(diào)節(jié)pH7.0，加酶量為0.29%，在50℃下酶解60min，測(cè)定酶解液水解度及其對(duì)羥自由基的清除率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 固液比對(duì)清除羥自由基的影響Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

從圖3可知，在固液比為1:4時(shí)，水解度及酶解物對(duì)羥自由基的清除率同時(shí)達(dá)到最高，隨著固液比的增大，底物濃度變小，水解度及清除率均呈下降趨勢(shì)，因此，固液比為1:4是比較適宜的。

2.2.2 加酶量對(duì)酶解物清除羥自由基的影響

固液比1:4，加酶量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，其他條件同2.2.1節(jié)，測(cè)定酶解液水解度及其對(duì)羥自由基的清除率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 加酶量對(duì)清除羥自由基的影響Fig.4 Effect of enzyme dose on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

從圖4可以看出，底物濃度保持不變，加酶量為0.2%時(shí)，酶解物對(duì)羥自由基的清除率最高，之后隨著酶使用量的增加，清除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并逐漸保持平穩(wěn)，DH最大時(shí)清除率并非最大。

2.2.3 pH值對(duì)酶解物清除羥自由基的影響

固液比1:4，調(diào)節(jié)pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他條件同2.2.1節(jié)，測(cè)定酶解液水解度及其對(duì)羥自由基的清除率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 pH值對(duì)清除羥自由基的影響Fig.5 Effect of pH on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由圖5可見，在pH6.5時(shí)，酶解物對(duì)羥自由基的清除能力最強(qiáng)，當(dāng)pH值超過(guò)6.5時(shí)，酶解物對(duì)羥自由基的清除能力明顯下降，而水解度在pH7.0時(shí)達(dá)到最大，這說(shuō)明在相同的作用時(shí)間下，酶活力最強(qiáng)時(shí)水解得到的肽不一定具有活性肽的結(jié)構(gòu)。

2.2.4 溫度對(duì)酶解物清除羥自由基的影響

固液比1:4，分別選取酶解溫度45、50、55、60、65℃，其他條件同2.2.1節(jié)，測(cè)定酶解液水解度及其對(duì)羥自由基的清除率，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶解溫度對(duì)清除羥自由基的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由圖6可見，酶解物對(duì)羥自由基的清除率隨溫度升高逐漸增大，在溫度為50℃時(shí)達(dá)到最高值，因此選擇最適酶解溫度為50℃，繼續(xù)提高溫度，清除率下降較快。這是因?yàn)楦哂诿缸饔玫臏囟确秶?，酶的性質(zhì)受到影響，從而影響酶解物對(duì)羥自由基的清除作用。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)清除羥自由基的影響

固液比1:4，分別選取酶解時(shí)間30、45、60、75、90min，其他條件同2.2.1節(jié)，測(cè)定酶解液水解度及其對(duì)羥自由基的清除率，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，酶解時(shí)間為60min時(shí)，酶解物顯示出最強(qiáng)的羥自由基清除作用。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，雖然水解度有所提高，但酶解物清除自由基的能力卻明顯下降。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，水解度與酶解物清除自由基的能力之間并沒有顯著的一致性規(guī)律。這可能是因?yàn)槊附馕飳?duì)羥自由的基清除作用主要取決于肽鏈中暴露的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)和肽的氨基酸序列，而與水解程度無(wú)直接相關(guān)性[16]。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)清除羥自由基的影響Fig.7 Effect of hydrolysis duration on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

2.3 優(yōu)化分析試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)SPSS V13.0軟件分析作單因素方差分析，結(jié)果表明溫度、時(shí)間、pH值三個(gè)因素對(duì)清除率有顯著影響。利用Design-Expert 6.0.10.Trial軟件，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平共20個(gè)試驗(yàn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，泥鰍肉酶解物清除羥自由基試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Response surface design arrangement and experimental results

對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，對(duì)模型進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，采用手動(dòng)優(yōu)化的方法對(duì)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，去掉對(duì)結(jié)果影響不顯著的項(xiàng)，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，模型及失擬項(xiàng)的P值分別為0.0001和0.1110，表明該模型擬合良好。其中溫度和pH值對(duì)響應(yīng)值有顯著的交互作用，溫度和時(shí)間的交互作用次之。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析表Table 2 Analysis of variance for fitted regression model

2.3.2 羥自由基清除率的響應(yīng)面分析

圖8 時(shí)間、溫度交互作用對(duì)清除率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of hydrolysis temperature and duration on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

由圖8可見，當(dāng)pH值和酶解時(shí)間不變時(shí)，隨著酶解溫度的升高，自由基清除率升高，增幅比較顯著，增加到一定程度后，變化不太明顯；當(dāng)pH值和酶解溫度不變時(shí)，自由基清除率隨著酶解時(shí)間的增加而升高，當(dāng)時(shí)間增加到一定程度時(shí)，自由基清除率基本上趨于平穩(wěn)。

由圖9可見，當(dāng)pH值和酶解時(shí)間不變時(shí)，隨著酶解溫度的升高，自由基清除率升高，增幅比較顯著，增加到一定程度后，基本上趨于平穩(wěn)；當(dāng)酶解時(shí)間和酶解溫度不變時(shí)，自由基清除率隨著pH值的升高而升高，且在pH值比較低時(shí)增幅比較顯著，隨著pH值進(jìn)一步提高，清除率逐漸下降。

圖9 pH值、溫度交互作用對(duì)清除率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of hydrolysis temperature and pH on hydroxyl free radical scavenging rate of loach muscle hydrolysate

2.3.3 最佳酶解工藝驗(yàn)證

經(jīng)軟件優(yōu)化后得到酶解的最佳條件為：酶解溫度54.48℃、酶解時(shí)間59.97min、pH6.47、固液比1:4、加酶量0.2%，清除率預(yù)測(cè)值為99.52%。在該條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的羥自由基清除率均值為(99.03±0.24)%，通過(guò)SPSS V13.0軟件做t檢驗(yàn)，置信區(qū)間為97.52%～99.57%，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異，說(shuō)明模型與實(shí)際相符，具有實(shí)際指導(dǎo)意義。酶解物的水解度為24.6%，IC50為0.57mg/mL，說(shuō)明優(yōu)化后的酶解條件可有效提高功能肽的制備效率。

中國(guó)陶瓷本身是古老的傳統(tǒng)產(chǎn)物，具有歷史性，我們推行藝術(shù)陶瓷的就更應(yīng)繼承中國(guó)文化傳統(tǒng)的喜聞樂見的文化元素，如以中國(guó)傳統(tǒng)題材、吉祥題材、中國(guó)陶瓷以線造型的優(yōu)秀傳統(tǒng)及中國(guó)傳統(tǒng)的審美觀，強(qiáng)調(diào)藝術(shù)陶瓷的特色，體現(xiàn)中國(guó)文化元素濃郁的東方藝術(shù)魅力，成為陶瓷藝術(shù)寶庫(kù)中一顆璀璨的明珠，對(duì)西方文化要有清晰的認(rèn)識(shí)，“洋為中用”，而不是追求西方的審美趣味和表現(xiàn)特點(diǎn)，當(dāng)前有些藝術(shù)工作者在藝術(shù)陶瓷設(shè)計(jì)中一味追求油畫、抽象畫、版畫的表現(xiàn)方法和效果，缺乏中國(guó)文化元素。面對(duì)外來(lái)藝術(shù)形式時(shí)，學(xué)習(xí)并吸收對(duì)自身有用的養(yǎng)分，不是簡(jiǎn)單的嫁接。

2.4 酶解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定Sephadex G-15凝膠柱的V0為17.95mL，Vt為39.94mL，由各標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間計(jì)算出相應(yīng)的Ve，進(jìn)而計(jì)算出有效分配系數(shù)Kav，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=－1.2895x+4.3499，R2=0.9978。

2.4.2 酶解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布及清除率的測(cè)定

圖10 泥鰍肉酶解液Sephadex G-15層析圖Fig.10 Sephadex G-15 gel chromatographic fractionation of loach muscle hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions

由圖10、11可見，具有較高羥自由基清除率的酶解物主要為第1洗脫峰和第2洗脫峰。峰1相對(duì)分子質(zhì)量為2344，IC50為0.36mg/mL；第2峰的相對(duì)分子質(zhì)量為1129，IC50為0.21mg/mL，因此泥鰍肉酶解物抗氧化活性肽是相對(duì)分子質(zhì)量范圍在1129～2344的活性肽，經(jīng)Sephadex G-15層析分離后的組分較酶解物對(duì)羥自由基的清除能力有很大提高(IC50下降)。

圖11 各分離組分的相對(duì)分子質(zhì)量和對(duì)羥自由基的清除率Fig.11 Comparisons on relative molecular mass and hydroxyl free radical scavenging rate of various separated fractions of loach muscle hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions

3 結(jié) 論

3.1 通過(guò)對(duì)酶解進(jìn)程及羥自由基清除能力研究發(fā)現(xiàn)，水解度與清除能力之間沒有相關(guān)性，酶法制備功能肽的關(guān)鍵可能在于選擇適合的酶及酶解條件的優(yōu)化。

3.2 菠蘿蛋白酶作為酶解泥鰍肉制備具有清除羥自由基活性肽的水解酶要優(yōu)于復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。

3.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解工藝條件是可行的，優(yōu)化得到的最佳酶解條件為：加酶量0.2%、溫度54.48℃、時(shí)間59.97min、pH 6.47、固液比1:4，酶解物對(duì)羥自由基的清除率為99.03%，IC50為0.57mg/mL。酶解液中活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量范圍為1129～2344。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Loach Muscle for Production of Antioxidant Peptides and Measurement of Their Molecular Weights

YAO Dong-rui1，WANG Shu-jun1，LI Yuan-yuan1，PAN Sai-kun1，YANG Fan1,2
(1. School of Food Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China；2. Food Engineering College, Dalian Ocean University, Dalian 116000, China)

Q514

A

1002-6630(2010)21-0029-06

2010-06-23

科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動(dòng)項(xiàng)目(2009GJC10044)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX09-627)；連云港市科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(CK0935)

姚東瑞(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及漁業(yè)經(jīng)濟(jì)。E-mail：yaodr@hhit.edu.cn