阿魏酸糖酯體外抗氧化性質(zhì)的研究

趙 冰，張 可，王 靜,*，孫寶國，曹雁平

阿魏酸糖酯體外抗氧化性質(zhì)的研究

趙 冰1，張 可2，王 靜1,*，孫寶國1，曹雁平1

(1. 北京工商大學化學與環(huán)境工程學院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2. 空軍航空醫(yī)學研究所，北京 100142)

采用內(nèi)切木聚糖酶酶解小麥麩皮不溶性膳食纖維制備阿魏酸糖酯。研究表明阿魏酸糖酯具有螯合金屬離子、清除H2O2、羥自由基、DPPH自由基的作用；與人工合成抗氧化劑BHT、VC相比，阿魏酸糖酯仍然表現(xiàn)出很強的抗氧化性質(zhì)，而且比游離態(tài)阿魏酸的抗氧化性質(zhì)高。

小麥麩皮；阿魏酸糖酯；自由基；抗氧化性質(zhì)

谷物膳食對人體健康及癌癥、心臟病、糖尿病[1]等的預防有重大意義，這與谷物中的膳食纖維和酚酸類物質(zhì)有很大的關(guān)系。這些物質(zhì)都具有潛在的抗氧化性質(zhì)。阿魏酸作為谷物中含量最為豐富的一種酚酸類物質(zhì)，具有很好的抗氧化性質(zhì)[2]。谷物中的阿魏酸一般是以酯鍵與阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基連接在一起的，通過適度的水解可以得到阿魏酸糖酯[3]。阿魏酸具有清除自由基、抗血栓、抗菌消炎、抑制腫瘤、防治高血壓、心臟病、增強精子活力等作用[4]。通過研究表明，以結(jié)合態(tài)存在的阿魏酸具有比游離態(tài)存在的阿魏酸更好的抗氧化性質(zhì)[5]。這已經(jīng)引起了學者們極大的研究興趣。

小麥作為世界上最為重要的糧食產(chǎn)物之一，是人體膳食的重要組成部分。近年來，我國每年大約有2000萬t的小麥麩皮，作為飼料成分的經(jīng)濟價值很低。因此，越來越多的人將其作為膳食纖維和酚酸類物質(zhì)的重要來源進行研究。本實驗采用內(nèi)切木聚糖酶酶解小麥麩皮不溶性膳食纖維制備阿魏酸糖酯，并研究阿魏酸糖酯的抗氧化性質(zhì)，為其作為添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮購自河北承德熱河面粉廠，經(jīng)粉碎過篩后備用。

內(nèi)切木聚,糖酶 武漢新華揚生物有限公司；樺木木聚糖、2,,2 -聯(lián)吡啶、脫氧核糖、DPPH、Amberlite XAD-2大孔吸附樹脂 Sigma公司；阿魏酸 天津市精細化工研究所。實驗中所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SHZ-82A恒溫振蕩器 國華電器有限公司；UV-Vis spectrophotometer SHIMADZU紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 木聚糖酶酶活力的測定[3]

將預熱到60℃的1mL的稀釋酶液加入到同樣預熱到60℃的1mL 10mg/mL木聚糖溶液中，兩種物質(zhì)都是用50mmol/L pH5.0醋酸鹽緩沖液配制而成，將其混勻后60℃反應30min，然后加入2mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻，沸水浴5min，流水快速冷卻，加水定容至25mL，波長540nm處測吸光度。以木糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，以吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。以每分鐘生成1μmol木糖所需要的酶量為一個活力單位，用U表示。

1.3.2 阿魏酸糖酯的制備

粉碎過篩的小麥麩皮經(jīng)一系列處理后，制備得到不溶性膳食纖維[6-7]，40℃真空干燥。再用內(nèi)切木聚糖酶在適宜條件下水解不溶性膳食纖維，制備阿魏酸糖酯。將酶解液離心取上清液，用大孔吸附樹脂進行純化[8]，用蒸餾水和甲醇進行洗脫。將洗脫得到的溶液收集，濃縮，再冷凍干燥，得到阿魏酸糖酯。

1.3.3 對金屬離子的螯合作用[9]

將0.25mL的1mmol/L FeSO4溶液與0.25mL不同質(zhì)量濃度的阿魏酸糖酯溶液(用1mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液配制)混合后，再分別加,入0.5mL pH7.4的Tris-HCl緩沖液、0.5mL 1mg/mL 2-2 -聯(lián)吡啶(用0.2mol/L HCl溶液溶解)、0.4mL 100mg/mL鹽酸羥胺溶液和2.5mL無水乙醇。以EDTA作為參照物，對照為不含測試樣品溶液。反應結(jié)束后用蒸餾水定容到5 m L，混勻，室溫下反應10min，在波長522nm處測定其吸光度，計算其螯合能力IC50。對鐵離子的螯合能力用公式(1)進行計算。

式中： A樣品為反應溶液中樣品或參考物質(zhì)存在情況下的吸光度；A對照為測試溶液中不含樣品或參考物質(zhì)情況下的吸光度。公式(2)～(4)同。

1.3.4 對H2O2的清除作用[10]

用1mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液在20℃制備H2O2溶液，H2O2的濃度在波長230nm處用比色法進行測定，該波長下H2O2的摩爾消光系數(shù)為81L/(mol·cm)[11]。取3.4mL不同質(zhì)量濃度的樣品液(用1mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液配制)與600μL H2O2溶液混合，反應10min，在波長230nm處比色測定H2O2的濃度，以VC和阿魏酸作參考物質(zhì)，計算其清除率IC50。樣品和標準物質(zhì)對H2O2的清除能力按公式(2)進行計算。

1.3.5 對羥自由基的清除作用[12]

將1mL不同濃度的樣品與200μL 3mmol/L的脫氧核糖、400μL 100μmol/L的FeC13與100μmol/L的EDTA預混合(l:l，V/V)、1mmol/L 200μL H2O2、200μL l00μmol/L的VC混合。反應混合物在37℃反應60min，然后加入2mL 5mg/mL TBA溶液(用100mg/mL三氯乙酸溶液配制)，混勻后，在沸水浴中加熱15min，流水迅速冷卻，在12000r/min離心5min，然后在波長532nm處測定上清液的吸光度。以阿魏酸作為參考物質(zhì)，計算其清除率IC50。清除效果按公式(3)進行計算。

1.3.6 對DPPH自由基清除作用[13]

將0.4mL不同濃度的樣品與1.6mL 100mmol/L pH7.4的Tris-HCl緩沖液、2.0mL 0.5mmol/L DPPH甲醇溶液進行混合，對照不含測試樣品。搖勻后，室溫下暗處反應30min，波長517nm處測定其吸光度。以BHT和阿魏酸作參考物質(zhì)，計算其清除率IC50。測試樣品的自由基清除能力按式(4)進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶的酶活力

通過測定得到木聚糖酶與木聚糖溶液反應后所得木糖的吸光度分別為0.473、0.470、0.474。得到其標準曲線方程為y=0.4405x－0.0061，R2=0.9996。計算得到木聚糖酶的酶活力為60233.33U/g。

2.2 阿魏酸糖酯對Fe2+的螯合作用

對金屬離子的螯合能力是抗氧化劑的一個重要性質(zhì)。酚酸類化合物的苯氧基具有很高的電荷密度，使得它能夠結(jié)合帶電的金屬離子，從而達到螯合和穩(wěn)定金屬離子的效果[14]。

圖1 阿魏酸糖酯和EDTA螯合金屬離子的能力Fig.1 Comparison of ferrous chelating capacity between ferulic acid sugar esters and EDTA

從圖1可,以看出，阿魏酸糖酯對Fe2+具有較強的螯合能力。2,2 -聯(lián)吡啶能定量地與Fe2+形成紅色螯合物，在有其他比其螯合能力更強的螯合劑存在的情況下，紅色螯合物的形成將被破壞，顏色也會發(fā)生變化。因此，可以通過測定顏色的變化來研究抗氧化劑的,螯合能力。在此實驗中，阿魏酸糖酯能夠抑制Fe2+與2,2 -聯(lián)吡,啶形成紅色螯合物。由此說明，阿魏酸糖酯能夠比2,2 -聯(lián)吡啶優(yōu)先結(jié)合Fe2+，從而表現(xiàn)出對Fe2+的螯合作用，阿魏酸糖酯的IC50大約為3.5mg/mL，阿魏酸糖酯對Fe2+的螯合作用呈劑量依賴關(guān)系，當阿魏酸糖酯質(zhì)量濃度達到4.0mg/mL，對Fe2+的螯合能力可以達到同質(zhì)量濃度EDTA的66.43%。

2.3 阿魏酸糖酯對H2O2的清除作用

圖2 阿魏酸糖酯和VC對H2O2的清除能力Fig.2 Comparison of hydrogen peroxide scavenging capacity between ferulic acid sugar esters and VC

圖3 阿魏酸和阿魏酸糖酯對H2O2的清除作用Fig.3 Comparison of hydrogen peroxide scavenging capacity between ferulic acid sugar esters and free ferulic acid

由圖2、3可以看出，阿魏酸糖酯對H2O2的清除作用呈濃度依賴關(guān)系。與VC比較，可以發(fā)現(xiàn)阿魏酸糖酯表現(xiàn)出很高的清除作用，當阿魏酸糖酯的質(zhì)量濃度達到0.5mg/mL時，其清除率可以達到同等質(zhì)量濃度VC的72.97%。而與阿魏酸相比也可以發(fā)現(xiàn)，相同濃度下的兩種物質(zhì)，阿魏酸糖酯的清除作用明顯高于阿魏酸，這種效果在低濃度的條件下更加明顯，阿魏酸糖酯的IC50大約為0.39mmol/L，而阿魏酸的IC50大約為0.42mmol/L。由于阿魏?；且粋€良好的電子供體，它們可能加速H2O2轉(zhuǎn)變成水，而顯示出對H2O2的清除作用，而結(jié)合態(tài)的阿魏酸由于低聚木糖的存在，使阿魏?；憩F(xiàn)出更高的清除作用。

2.4 阿魏酸糖酯對羥自由基的清除作用

圖4 阿魏酸和阿魏酸糖酯對羥自由基的清除作用Fig.4 Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacity between ferulic acid sugar esters and free ferulic acid

如圖4所示，阿魏酸糖酯對羥自由基具有明顯的清除作用，其清除率與阿魏酸糖酯存在劑量依賴關(guān)系，即隨著阿魏酸糖酯濃度的增加，對羥自由基的清除作用也隨著增加，對于相同濃度的阿魏酸和阿魏酸糖酯來說，阿魏酸糖酯表現(xiàn)出更高的清除作用；阿魏酸的IC50大約為1.3mmol/L，而阿魏酸糖酯的IC50大約為0.6mmol/L，還不到阿魏酸的一半，這就表明了阿魏酸糖酯具有更優(yōu)越的清除羥自由基的作用。這就使得阿魏酸糖酯可以保護食品、保健品等中的糖類物質(zhì)免受羥自由基誘導的氧化損害[15]。

2.5 阿魏酸糖酯對DPPH自由基的清除作用

圖5 阿魏酸糖酯和BHT對DPPH自由基清除作用Fig.5 Comparison of DPPH free radical scavenging capacity between ferulic acid sugar esters and BHT

圖6 阿魏酸和阿魏酸糖酯對DPPH自由基清除作用Fig.6 Comparison of DPPH free radical scavenging capacity between ferulic acid sugar esters and free ferulic acid

從圖5、6可以看出，阿魏酸糖酯對DPPH自由基具有強烈的清除作用。由圖5可知，當阿魏酸糖酯的質(zhì)量濃度在0～2.0mg/mL時，清除能力的增加非常明顯；質(zhì)量濃度超過2.0mg/mL時，清除能力增加非常緩慢，清除能力可以達到60%左右，雖然阿魏酸糖酯的清除能力不如BHT，但是作為天然無毒的物質(zhì)，仍然具有很高的利用價值，而且當阿魏酸糖酯的質(zhì)量濃度達到10mg/mL時，它的清除能力可以達到近70%，已經(jīng)很接近BHT的清除率了。從圖6可以看出，阿魏酸糖酯的清除能力高于阿魏酸，阿魏酸糖酯的IC50大約為1mmol/L，而阿魏酸的IC50大約為2.8mmol/L。

3 結(jié) 論

阿魏酸糖酯具有良好的抗氧化效果。阿魏酸糖酯具有螯合金屬離子、清除H2O2、·OH、DPPH自由基的作用，在一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，與人工合成抗氧化劑相比也不處于劣勢，因此，阿魏酸糖酯具有很強的抗氧化功能，可以作為抗氧化劑進行使用。研究還發(fā)現(xiàn)，與游離態(tài)阿魏酸[16]相比，阿魏酸糖酯表現(xiàn)出高得多的抗氧化性質(zhì)，這可能與阿魏酸糖酯的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，阿魏酸糖酯所帶的低聚木糖殘基和阿拉伯糖殘基使阿魏酸糖酯表現(xiàn)出更高的生物活性，使其既具有阿魏酸的性質(zhì)，又具有低聚木糖的性質(zhì)。而且阿魏酸糖酯還解決了阿魏酸作為食品添加劑的水溶性問題，阿魏酸糖酯在水中具有很高的溶解性，而且具有很好的耐熱性。因此，阿魏酸糖酯在添加劑行業(yè)具有廣闊的應用前景。

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Antioxidant Properties of Ferulic Acid Sugar Esters in vitro

ZHAO Bing1，ZHANG Ke2，WANG Jing1,*，SUN Bao-guo1，CAO Yan-ping1
(1. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Institute of Aviation Medicine, Air Force, Beijing 100142, China)

The ferulic acid sugar esters prepared from wheat bran hydrolyzed by endo-xylanase were characterized for their antioxidant properties in vitro reflected by the abilities to scavenge hydrogen peroxide as well as hydroxyl and DPPH free radicals and to chelate metals using two synthetic antioxidants, BHT and VC, as the controls. The sugar esters were found to have strong antioxidant properties, which were better than those of free ferulic acid.

wheat bran；ferulic acid sugar esters；radicals；antioxidant properties

TS202.3

A

1002-6630(2010)21-0094-04

2010-06-12

北京市教委面上項目(KM200910011002)；北京市科學技術(shù)委員會科技新星項目(2008B07)

趙冰(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為農(nóng)副產(chǎn)品資源的開發(fā)利用。E-mail：zhaobtg@163.com

*通信作者：王靜(1976—)，女，副教授，博士，研究方向為農(nóng)副產(chǎn)品資源的開發(fā)利用。E-mail：jwang810@yahoo.com.cn