不同力學(xué)環(huán)境對構(gòu)建組織工程軟骨影響的研究進展

劉 濤 綜述，賈宏偉 審校

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津 300052）

因外傷或某些疾病如骨性關(guān)節(jié)炎、干燥性骨軟骨炎都可導(dǎo)致軟骨損傷、缺損，臨床上十分常見。軟骨自身是一種無血管組織，損傷后自行修復(fù)能力極為有限，傳統(tǒng)的治療方法有軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨移植、骨膜或軟骨膜移植、軟骨細(xì)胞移植等。小面積的軟骨缺損一般行損傷軟骨切除術(shù)或穿透性治療，暴露下方的松質(zhì)骨，使骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞向上遷移而修復(fù)缺損，這也只能在一定程度上緩解疼痛，且當(dāng)軟骨缺損直徑大于4mm時已很難修復(fù)。由于再生軟骨的生物化學(xué)和機械性能不等同于正常軟骨，容易退變和侵蝕，耐久性差，也不能取得滿意臨床效果[1]。應(yīng)用組織工程方法修復(fù)軟骨缺損展示了令人鼓舞的前景。組織工程修復(fù)軟骨手段的目的是將修復(fù)物質(zhì)運送到受損部位并且固定于該位置以達到有效的修復(fù)。從研究結(jié)果來看，雖然研究者們應(yīng)用了多種方法研究生物材料、種子細(xì)胞和修復(fù)，但修復(fù)軟骨的長期效果并不令人滿意，存在著組織工程軟骨中心強度低、難以和宿主正常軟骨整合、軟骨和軟骨下骨的斷裂分層問題等難題，是亟待解決的問題[2]。近期研究表明，適當(dāng)?shù)牧W(xué)環(huán)境作為一個必要的生理性刺激因素可以在一定程度上克服傳統(tǒng)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)條件的不足，滿足細(xì)胞的營養(yǎng)需要，減少處于中心部位的軟骨細(xì)胞由于營養(yǎng)不良或代謝不暢而導(dǎo)致的生長遲滯甚至死亡[3]。

1 軟骨的結(jié)構(gòu)

軟骨由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)構(gòu)成，軟骨細(xì)胞包埋于軟骨陷窩內(nèi)，軟骨基質(zhì)由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。基質(zhì)主要由固相和液相兩部分組成。具通透性的多孔固相主要由膠原纖維、凝膠樣蛋白多糖組成，其他成分還包括脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)及糖蛋白。細(xì)胞外液相由水、離子和營養(yǎng)質(zhì)組成?？偟膩碚f，軟骨細(xì)胞占組織體積的1%～10%，維持細(xì)胞外基質(zhì)成分合成與分解的平衡。細(xì)胞外基質(zhì)主要為水、膠原和蛋白多糖，其他成分包括脂肪、蛋白質(zhì)、糖蛋白和無機鹽等。水是正常軟骨中最豐富的成分，占濕重的65%～80%。膠原是軟骨干重的主要成分，占50%～80%，主要組分是3股相同α多肽鏈螺旋排列而成的Ⅱ型膠原。膠原纖維構(gòu)成軟骨的纖維骨架，與高度含水的蛋白多糖長鏈結(jié)構(gòu)共同形成網(wǎng)絡(luò)狀基質(zhì)。當(dāng)軟骨承受外力時，引起液體外流，蛋白多糖濃度增加，滲透壓增大以對抗外壓力，同時將壓力傳遞給膠原纖維，使壓應(yīng)力轉(zhuǎn)化為張應(yīng)力。

2 不同的力學(xué)環(huán)境對軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的影響

2.1 壓力環(huán)境 正常人體所承受的最主要是自身體重產(chǎn)生的壓力。在組織工程體外模擬環(huán)境中，主要采用的壓力為持續(xù)靜壓和動態(tài)壓力。

2.1.1 持續(xù)靜壓力環(huán)境 早期的研究多采用持續(xù)靜壓力的模擬環(huán)境，所得到的結(jié)果不一。劉文華等[4]應(yīng)用兔后肢的髕股關(guān)節(jié)間造成持續(xù)及間歇的不同壓應(yīng)力模型，表明關(guān)節(jié)間持續(xù)及間歇的較高壓應(yīng)力可以引起軟骨細(xì)胞凋亡，并繼而出現(xiàn)軟骨退變，IL-1β和TNF-α在軟骨細(xì)胞凋亡過程中可能起重要作用。漢斌等[5]對兔髁突軟骨細(xì)胞施加靜壓應(yīng)力測得II型膠原和結(jié)締組織生長因子mRNA增高。Salter等[6]通過對髁突軟骨細(xì)胞施加90kPa壓強，測得IL-4、IL-6表達增強，由于IL-4可抑制力學(xué)刺激下軟骨細(xì)胞膜的超極化作用故又被稱為軟骨保護因子，且IL-4是人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞重要的力學(xué)信號傳導(dǎo)通路之一[7]。而IL-6具有參與骨吸收、抑制成纖維細(xì)胞生長、促進多種細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)活性[8]，表明適當(dāng)壓力可保護軟骨，促進細(xì)胞增殖[9]。

2.1.2 動態(tài)壓力環(huán)境 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是處于關(guān)節(jié)內(nèi)特殊的動態(tài)壓力環(huán)境之中，其功能和結(jié)構(gòu)必然受壓力的影響和調(diào)控[10]。Schulz等[11-12]發(fā)現(xiàn)生理范圍內(nèi)的動態(tài)載荷可以刺激軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)合成，形成更有組織性的結(jié)構(gòu)。Smith等[13]采用循環(huán)壓力對軟骨細(xì)胞進行加壓，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞呈高密度聚集，迅速生長、繁殖，分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力明顯增強。Wang等[14]研究表明循環(huán)壓力下I型膠原表達增加，蛋白聚糖基因活化。蔡俊等[15]通過分離關(guān)節(jié)軟骨種植于PGA支架在循環(huán)壓力下培養(yǎng)得到的組織工程軟骨形態(tài)和色澤更加接近正常透明軟骨，厚度和組織彈性優(yōu)于對照組，軟骨細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外基質(zhì)合成明顯增加，分泌Ⅱ型膠原能力更強。Hu等[16.]發(fā)現(xiàn)在10MPa的循環(huán)壓力下，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)8周后仍能在陷窩中維持球形，膠原數(shù)量仍然大量增加，而對照組糖胺多糖降低到非常低的水平。Toyoda等[17]也證實了三維瓊脂凝膠中的軟骨細(xì)胞在5MPa的壓力下糖胺多糖顯著增加，蛋白聚糖mRNA增至4倍。

2.2 張應(yīng)力環(huán)境 在體內(nèi)牽張應(yīng)力的作用下，軟骨組織變形，附著于軟骨基質(zhì)上的軟骨細(xì)胞可產(chǎn)生相應(yīng)的牽拉變形，因此，牽張應(yīng)力的加載裝置主要是通過各種方法對培養(yǎng)基膜的牽拉，使粘附于基膜上的軟骨細(xì)胞被動伸展[18]。Hirano等[19]發(fā)現(xiàn)張應(yīng)變可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞形態(tài)的明顯改變，動態(tài)性張應(yīng)變(16%，24h)導(dǎo)致Ⅱ型膠原的合成增加，而靜態(tài)性張應(yīng)變(16%，24h)誘導(dǎo)氮氧化物的產(chǎn)量明顯增加，引起軟骨基質(zhì)的分解。Ueki等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞增殖期，間斷張應(yīng)變(0.5或2.5Hz)明顯上調(diào)軟骨細(xì)胞的DNA合成，促進了軟骨細(xì)胞的增殖；在軟骨基質(zhì)形成期，這種間斷張應(yīng)變可以顯著促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，并且隨著頻率的增加，Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成有增加的趨勢。Nicodemus等[21]研究表明，交叉連接的多聚水凝膠支架促進了軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成。

2.3 剪切力環(huán)境 流體剪切力是機體內(nèi)微環(huán)境重要組成部分。Stoddart等[22]報道短時間剪切應(yīng)力環(huán)境下糖胺多糖的mRNA表達增加60%，蛋白聚糖和II型膠原mRNA也有增加。Kessler等[23]對單層培養(yǎng)的牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上施加流體剪切力，發(fā)現(xiàn)流體剪切力（3.5Pa，96h）可明顯增強軟骨細(xì)胞增殖至3.5倍，且單層細(xì)胞形態(tài)更圓、更具軟骨表型（在軟骨組織工程中維持體外軟骨細(xì)胞表型是第一步的，并可分泌大量的TGF-β）[24]。Waldman等[25-26]聯(lián)合應(yīng)用壓應(yīng)力和剪切應(yīng)力使細(xì)胞外基質(zhì)（膠原和蛋白多糖）大量增加，同時機械性能也有所提高。

2.4 離心力環(huán)境 離心力可以促進單層培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增生，一定程度上刺激堿性磷酸酶的活性。離心力還可以刺激成纖維細(xì)胞分泌I型膠原。Inoue等[27]通過將兔生長板和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞置于129～540r/min離心力環(huán)境中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)蛋白多糖和DNA合成均有增加。王建等[28]應(yīng)用兔軟骨細(xì)胞與各種支架混合，置于離心管內(nèi)培養(yǎng)，均形成了軟骨樣組織，說明軟骨細(xì)胞可在離心管內(nèi)形成組織工程軟骨。孔清泉等[29]報道將兔軟骨細(xì)胞置于1000r/min離心機上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)糖胺多糖和II型膠原分泌增加，并且軟骨組織排列較靜態(tài)培養(yǎng)具有一定層次。考慮是離心力發(fā)揮了類似生物體內(nèi)應(yīng)力作用，使細(xì)胞在離心力作用下在指甲中形成了一定的初期分布，利于營養(yǎng)物質(zhì)交換和細(xì)胞代謝，促進了細(xì)胞增殖。

3 研究展望

體內(nèi)的力學(xué)環(huán)境極其復(fù)雜，完全模擬體內(nèi)環(huán)境構(gòu)建組織工程軟骨較為困難。適當(dāng)?shù)膲簯?yīng)力、張應(yīng)力、剪切力、離心力均可以提供一定的力學(xué)刺激，促進軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，改善基質(zhì)的分布，進一步改進組織工程軟骨的生物力學(xué)性能。

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