食管鱗狀細(xì)胞癌組織中乏氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白和 mRNA的表達(dá)

吳欣愛,王筱璨,樊青霞,王留興,李 鑫,王瑞林,姜中興

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科鄭州 450052 2)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2005級(jí)長沙 410008 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052

#通訊作者,男,1965年生,碩士,教授,研究方向:白血病診斷與治療,E-mail:jzx8888@yahoo.com.cn

由于乏氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)對(duì)腫瘤適應(yīng)乏氧微環(huán)境起著關(guān)鍵作用,近年來受到更多學(xué)者的關(guān)注。研究[1]表明,人類多數(shù)腫瘤內(nèi)都有顯著的乏氧區(qū)域,多數(shù)腫瘤組織中存在 HIF-1α的高表達(dá)[2]。為了解食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)組織中HIF-1α的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系,作者進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 食管鱗癌組織標(biāo)本及臨床病理資料 收集2005年 11月至 2006年 8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院食管癌手術(shù)切除標(biāo)本,共 46例。標(biāo)本均在離體 0.5 h內(nèi),于冰上分離食管癌灶組織,置液氮中保存?zhèn)溆谩?6例中男 34例,女 12例;年齡 38～71歲,中位年齡55歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行任何放、化療及其他特殊治療。詳細(xì)記載每例患者的性別、年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)及 TNM分期情況等臨床病理資料[3]。另選同期行胃鏡檢查確診為正常的食管黏膜組織(46例)作為對(duì)照,保存及觀察方法同鱗癌組織。

1.2 食管鱗癌及正常食管黏膜組織中HIF-1α蛋白表達(dá)的免疫組化檢測 石蠟標(biāo)本 4μm厚切片,常規(guī)脫蠟至水。按照免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書的步驟操作。HIF-1α一抗工作濃度為 1∶50。參考文獻(xiàn)[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn):于 200倍顯微鏡下隨機(jī)觀察 10個(gè)視野,以細(xì)胞胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒著色者為陽性細(xì)胞;陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性表達(dá),≥10%為陽性表達(dá)。

1.3 食管鱗癌及正常食管黏膜組織中 HIF-1α m RNA表達(dá)的RT-PCR檢測 從液氮中取凍存組織約100mg,采用Trizol法分別提取2種組織中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20μL)組成:DEPC水7 μL,5×Buffer 4μL,dNTPs(10 nmol/L)2μL,Oligo (dT)1μL,RNase抑制劑1μL,總RNA 4μL,逆轉(zhuǎn)錄酶1μL。PCR引物序列:β-actin上游引物:5'-CATCCTGCGTCTGACCT-3',下游引物:5'-TCAGG AGGAGCAATGATCTTG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為480 bp。HIF-1α上游引物:5'-CCTGCACTCAATCA AGAAGTTGC-3',下游引物:5'-TTCCTGCTCT GTTTGGTGAGGCT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為618 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s, 55.6℃退火30 s,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán);再72℃繼續(xù)延伸5min,置4℃保存。取PCR產(chǎn)物20 μL,分別加溴酚藍(lán)6μL,混勻,加樣于含有EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(5 V/cm),電泳時(shí)間20 min。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析照相,計(jì)算機(jī)分析讀取各條產(chǎn)物帶的灰度值,并與β-actin的灰度值相比,以此代表目的片段的相對(duì)表達(dá)值。以癌組織中HIF-1αmRNA與β-actin mRNA灰度值的比值大于平均值者為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行分析,采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較食管鱗癌及正常黏膜組織中HIF-1αmRNA的表達(dá),采用χ2檢驗(yàn)分析食管鱗癌組織中HIF-1α蛋白和mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系,計(jì)算食管鱗癌組織中HIF-1αmRNA與蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌及正常食管黏膜組織中HIF-1α蛋白的表達(dá) 食管鱗癌組織中HIF-1α蛋白陽性染色主要位于癌細(xì)胞胞質(zhì)/核內(nèi),陽性率為 41.3%(19/ 46),而正常食管黏膜組織中 HIF-1α蛋白均呈陰性表達(dá)。見圖 1。

圖1 正常食管黏膜組織(A)及

2.2 食管鱗癌及正常黏膜組織中HIF-1αm RNA的表達(dá) 食管鱗癌組織及正常食管黏膜組織均可見HIF-1αmRNA的表達(dá)。食管鱗癌組織中HIF-1α mRNA的表達(dá)水平(1.17±0.25)高于正常食管黏膜組織(0.35±0.12)(t=13.942,P＜0.001)。46例鱗癌組織中HIF-1αmRNA高表達(dá)者24例,高表達(dá)率為52.2%。

2.3 食管鱗癌組織中HIF-1αmRNA與蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 見表1。

表1 食管鱗癌組織中HIF-1αm RNA和蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 例

2.4 HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

HIF-1屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族,基因定位于人染色體14q21～24,是一個(gè)由HIF-1α和HIF-1β組成的異二聚體結(jié)構(gòu),2個(gè)亞單位的相對(duì)分子質(zhì)量分別為 120×103和(91～94)×103[5];研究[6]表明,HIF-1的亞單位HIF-1α是一個(gè)含826個(gè)氨基酸的多肽,在401～603區(qū)域有一個(gè)氧依賴降解區(qū)(oxygen-dependent degradation domain,ODD),它對(duì)氧的依賴性較強(qiáng),主要起乏氧調(diào)節(jié)作用,決定 HIF-1的活性。

近年來研究[7-8]顯示,在大多數(shù)人類正常組織中未檢測到HIF-1α的表達(dá),而在許多腫瘤組織中存在HIF-1α的過表達(dá),且與預(yù)后密切相關(guān)。食管癌組織中HIF-1α表達(dá)的研究國內(nèi)未見詳細(xì)報(bào)道,而國外較少的研究報(bào)道結(jié)論不一[9-10]。作者的研究結(jié)果顯示HIF-1αmRNA普遍存在于食管鱗癌組織及正常食管黏膜組織中,但在癌組織中的表達(dá)高于正常食管黏膜組織。食管鱗癌組織中HIF-1α蛋白的陽性率為41.3%(19/46),而正常食管黏膜組織中呈陰性表達(dá)。有關(guān)HIF-1α陽性染色部位在不同的腫瘤中報(bào)道不一:肺腺癌細(xì)胞以胞質(zhì)著色為主[11],而骨肉瘤細(xì)胞以胞核著色為主[12]。該研究顯示食管鱗癌組織中HIF-1α蛋白陽性著色位于癌細(xì)胞胞質(zhì)/核內(nèi)。這種組織器官著色部位的差異性機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

有研究[4]報(bào)道,HIF-1α與結(jié)腸癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移有關(guān);而在肺癌中,HIF-1α的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)類型無關(guān),但與腫瘤的分期有關(guān)[13]。該研究結(jié)果顯示:食管鱗癌組織中mRNA表達(dá)水平的高低與臨床病理特征無關(guān),但癌組織中mRNA表達(dá)水平的高低與HIF-1α蛋白陽性率的高低呈正關(guān)聯(lián),且HIF-1α蛋白的表達(dá)與腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。作者的研究結(jié)果提示食管鱗癌組織中HIF-1α在蛋白水平的表達(dá)更有臨床意義。

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