劉玲,高佳,潘素君,胡亞軍,劉雄倫,王國梁,戴良英*
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院;b.水稻基因組學(xué)實驗室,湖南 長沙 410128;2.俄亥俄州州立大學(xué) 植物病理系,俄亥俄州 哥倫布 43210)
促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一類存在于所有真核生物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[1-4].BWMK1是第1個被克隆鑒定的水稻MAPK基因,它不僅受稻瘟菌浸染和創(chuàng)傷強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)[5],還受低溫、干旱、黑暗和茉莉酸的誘導(dǎo),苯并噻二唑(BTH)、光照和水楊酸則負(fù)調(diào)控其表達(dá)[6].BWMK1與植物防御、脅迫和生長發(fā)育相關(guān),并可能在植物不同的信號傳導(dǎo)途徑中起交叉?zhèn)鲗?dǎo)作用[6]. 過量表達(dá)BWMK1的轉(zhuǎn)基因煙草,植株葉片上形成自發(fā)性的過敏性壞死病斑,防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)水平顯著提高,而且表現(xiàn)出對煙草黑脛病和野火病的抗病性[7].為了探求BWMK1參與植物信號傳導(dǎo)的途徑及其作用,筆者通過酵母雙雜交體系,獲得了7個BWMK1互作基因BWIP1~BWIP7.從中選取BWIP4(水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)基因,構(gòu)建了BWIP4-RNAi表達(dá)載體pANDA-BWIP4和超表達(dá)載體NCGR-1300-BWIP4,經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將 pANDA-BWIP4和 NCGR-1300-BWIP4導(dǎo)入粳稻日本晴中,分析了BWMK1互作基因BWIP4的功能及其調(diào)控的抗病信號途徑.
供試粳稻品種日本晴、農(nóng)桿菌菌株EHA105、大腸桿菌DH10B、BWIP4干涉表達(dá)載體pANDABWIP4和超表達(dá)載體NCGR-1300-BWIP4,均為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻基因組學(xué)實驗室保存.
1.2.1BWIP4基因干涉載體和超表達(dá)載體構(gòu)建
將目的片段克隆到 pEUTR?載體(購自Invitrogen 公司).帶有目的片段載體 pEUTR?載體,通過位點(diǎn)特異性重組基因克隆技術(shù)重組構(gòu)建在pANDA載體中,完成RNAi(pANDA-BWIP4)干涉載體的構(gòu)建,干涉載體克隆引物序列,BWIP4Fi:5′-CACCGCAGACGGCGTAGTGTATGA-3′;BWIP4Ri:5′-GTGCCAAATTGCTGGTCTG-3′.
利用PCR引物中引入的酶切位點(diǎn),以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,擴(kuò)增BWIP4全長cDNA,構(gòu)建超表達(dá)載體(NCGR-1300-BWIP4).超表達(dá)載體克隆引物序列,BWIP4Fox:5′-GGCGCGCCATGGCGC GGCAGGAG-3′;BWIP4Rox:5′-TTAATTAACTAC GCCGTCTGCGGCCGCAC-3′.
質(zhì)粒提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等參照文獻(xiàn)[8]方法.所用培養(yǎng)基配方及轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[9]、[10].
1.2.2 轉(zhuǎn)化體系
農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化:水稻愈傷誘導(dǎo)10~15 d,愈傷繼代10~15 d,農(nóng)桿菌(菌液OD值0.8左右)浸染水稻愈傷30 min左右,共培養(yǎng)2~3 d (26 ℃暗培養(yǎng)),50 mg/L 潮霉素篩選,預(yù)分化至出綠點(diǎn),分化成苗,1/2MS+50 mg/L潮霉素生根培養(yǎng)基生根,移栽幼苗.
1.2.3 GUS活性測定
水稻細(xì)胞中GUS基因的表達(dá)基本按文獻(xiàn)[11]方法測定.水稻組織在含10 mmol/L EDTA、100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液、0.5 mmol/L 亞鐵氰化鉀、0.5 mmol/L 高鐵氰化鉀、0.1 %X-Gluc溶液中37 ℃保溫過夜.
1.2.4 水稻葉片DNA和總RNA的提取
按CTAB法提取轉(zhuǎn)基因水稻DNA,溶于無菌水,用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳估計其濃度,置于-20 ℃下保存?zhèn)溆?
轉(zhuǎn)基因水稻葉片總RNA的提取及轉(zhuǎn)錄合成cDNA參照文獻(xiàn)[8].
1.2.5 轉(zhuǎn)基因株系抗潮霉素基因PCR檢測
轉(zhuǎn)基因植株潮霉素抗性標(biāo)記基因鑒定引物為hpt-2F:5′-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3′,hpt-2R:5′-GTGCTTGACATTGGGGAGTT-3′. 采用20 μL的PCR反應(yīng)體系,其中含有2 μL Buffer、2 μL dNTPs、PCR 正、反向引物各1.0 μL、Taq酶0.4 μL,水稻模板DNA 約100 ng.?dāng)U增反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.0 min,循環(huán)32 次,最后72 ℃延伸7 min.PCR產(chǎn)物于4 ℃保存.以日本晴非轉(zhuǎn)化水稻DNA,在相同條件下進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對照,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.
1.2.6 轉(zhuǎn)基因株系RT-PCR檢測
對抗潮霉素陽性植株RT-PCR檢測,參照Takara公司RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行.引物序列,BWIP4-1F:5′-TCACCCTCATCATCTCCTC C-3′;BWIP4-1R:5′-GCTGTTCCGGGTCACCATC -3′.
基于pANDA空載體KpnI和SacI雙酶切能切開約4.4 kb左右的條帶,如果目的片段與pANDA載體重組位點(diǎn)成功置換,那么利用KpnI和SacI雙酶切能切出1.4 kb左右的條帶.將含BWIP4基因的RNAi重組質(zhì)粒經(jīng)KpnI和SacI對雙酶切鑒定,得到了1.4 kb左右的目的片段(圖1),與預(yù)期結(jié)果相符.證明基因成功重組到表達(dá)載體中.
鑒于表達(dá)載體NCGR-1300不包含BamHI和KpnI這2個酶切位點(diǎn),而BWIP4基因序列中包含這2個酶切位點(diǎn),利用這2個酶切位點(diǎn)鑒定超表達(dá)載體,BamHI和KpnI雙酶切重組質(zhì)粒NCGR-1300-BWIP4,得到2條酶切片段,其中小片段約為1.2 kb左右(圖2),符合BWIP4基因序列中兩酶切位點(diǎn)間的距離,證明目的基因BWIP4已成功導(dǎo)入NCGR-1300中.
圖 1 BWⅠP4 干涉載體KpnⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定Fig.1 Ⅰdentification of BWIP4 RNAi constructs by Kpn Ⅰ + Sac Ⅰ
圖 2 BWⅠP4 超表達(dá)載體NCGR-1300-BWⅠP4 Bam HⅠ和 KpnⅠ雙酶切鑒定Fig.2 Ⅰdentification of BWIP4 over-expression construct by digestion
利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 pANDA-BWIP4和NCGR-1300-BWIP4載體導(dǎo)入日本晴,經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)、共培養(yǎng)、篩選、預(yù)分化、分化和生根,獲得了35個BWIP4-RNAi和136個BWIP4-Overexpression轉(zhuǎn)基因水稻株系.
將經(jīng)共培養(yǎng)后的愈傷組織、分化后得到的 T0代植株的根和葉以及T1代種子進(jìn)行GUS檢測.結(jié)果顯示,有些愈傷組織可以觀察到藍(lán)色反應(yīng),表明攜帶了GUS基因.T0代植株的根、葉和T1代種子部分呈藍(lán)色反應(yīng),表明 GUS基因已經(jīng)整合到植株染色體上并得到表達(dá).
提取轉(zhuǎn)基因水稻總DNA,利用抗Hyg基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到約837 bp的條帶(圖3),其中,BWIP4-RNAi轉(zhuǎn)化植株成功擴(kuò)增出抗Hyg基因的植株與GUS顯色反應(yīng)的株系一致.
圖 3 轉(zhuǎn)基因株系抗Hyg基因PCR檢測Fig.3 Ⅰdentification of transgenic lines by PCR
用引物BWIP4-F/BWIP4-R對反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,BWIP4-RNAi轉(zhuǎn)基因株系和BWIP4-Overexpression轉(zhuǎn)基因株系中都得到了約296 bp大小的特異條帶.在RNAi株系中,BWIP4的表達(dá)量明顯低于日本晴,說明這一基因在RNAi株系中得到成功干擾(圖4-A).超表達(dá)株系中,BWIP4的表達(dá)量明顯高于日本晴,說明這一基因在轉(zhuǎn)基因株系中得到超表達(dá)(圖4-B).
圖 4 轉(zhuǎn)基因株系BWⅠP4 RT-PCR分析Fig.4 Expression level analysis of BWIP4 transgenic plants
本研究對已獲得的干涉和超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系通過 GUS、PCR和 RT-PCR檢測,獲得 4個BWIP4-RNAi和5個BWIP4超表達(dá)陽性轉(zhuǎn)基因株系,為進(jìn)一步分析BWIP4基因及其相關(guān)基因功能奠定了基礎(chǔ).在很多高等植物中已經(jīng)證實,高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于Pht1和Pht2兩個主要的基因家族,且大多數(shù)植物高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于Pht1家族[12-15].BWIP4(屬于Pht1家族)是一個水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,但至今為止有關(guān)BWIP4基因和功能的研究報道較少.將分析BWIP4基因過量表達(dá)和干涉時,水稻在不同磷含量環(huán)境條件下對磷素的吸收效率和對病原菌侵染的表型反應(yīng),以及相關(guān)基因表達(dá)量的變化,從而深入探討B(tài)WIP4基因在水稻抗病途徑中的作用機(jī)制.
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英文編輯:胡東平