舒巴坦鈉和EDTA使產ESBLs雞大腸桿菌恢復對抗菌藥物敏感性

劉保光，劉建華，吳華，陳玉霞，胡功政，徐利納，陳燕杰，孟春萍

（河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002）

產生超廣譜 β-內酰胺酶（extended spectrum β-lactamases, ESBLs）是細菌對β-內酰胺類抗生素耐藥最重要的機制[1]．ESBLs主要由腸桿菌科細菌產生，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌是其代表菌種，其他如沙門菌、枸櫞酸桿菌等也可產生[2]．ESBLs的特點是其能水解氧氨基頭孢菌素和氨曲南，但能被β-內酰胺酶抑制劑所抑制[3]．ESBLs產生菌，不僅對β-內酰胺環(huán)類抗生素耐藥，而且也對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、氟苯尼考、多西環(huán)素耐藥[4]，即呈多重耐藥特點．將β-內酰胺環(huán)類抗生素與β-內酰胺酶抑制劑舒巴坦鈉聯用，可大大提高其對產 ESBLs抗菌的活性[5]．舒巴坦鈉與β-內酰胺環(huán)類聯用的抗菌作用國內外已有報道[5-7]，膜通透性促進劑 EDTA能增加抗菌藥物對細菌的抗菌作用國外已有報道[8]，在國內僅有 1篇[9]．關于舒巴坦鈉、EDTA對產ESBLs菌的抗菌作用，河南農業(yè)大學獸醫(yī)藥理學實驗室已有的研究結果表明，在動物方面，產ESBLs與膜通透性降低在細菌多重耐藥產生中有協同作用，但首次研究試驗菌株較少，僅有6株．為了使結果更具代表性，筆者選擇 18株新近分離的產ESBLs雞大腸桿菌，分別研究酶抑制劑舒巴坦鈉、膜通透性促進劑EDTA及二者聯用對抗菌藥物敏感性的影響，為產ESBLs雞大腸桿菌感染的控制提供理論依據．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

18株產ESBLs雞大腸桿菌，由河南農業(yè)大學獸醫(yī)藥理學實驗室分離，是從24株雞大腸桿菌分離菌中按CLSI方法[10]通過表型篩選和確證實驗證實后選出的，經過法國生物梅里埃Vitek-32全自動細菌鑒定儀鑒定．質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，由中國普通微生物菌種保存中心提供．

1.1.2 培養(yǎng)基

主要培養(yǎng)基成分為 MH肉湯、麥康凱瓊脂、MH（A）培養(yǎng)基和GN增菌液．

1.1.3 藥敏紙片及藥品

氨曲南 （AZT，每片30 μg）、頭孢曲松 （CRO，每片30 μg）、頭孢泊肟 （CPO，每片30 μg）、頭孢噻肟 （CTX，每片30 μg）、頭孢噻肟/棒酸 （CTC，每片30/10μg）、頭孢他啶 （CAZ，每片30 μg）、頭孢他啶/棒酸 （CAC，每片30/10μg）均由北京天壇藥物公司提供．加替沙星（GAT）、乳酸環(huán)丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、磷霉素（FOS）、舒巴坦鈉（SBT）、頭孢噻呋（CTF）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢吡肟（CPM）、多西環(huán)素（DOX）、阿米卡星（AK）和氟苯尼考（FLO）均由河南牧翔動物藥業(yè)有限公司提供．

1.1.4 試驗儀器

主要試驗儀器為Vitek-32全自動細菌鑒定儀、磁力攪拌器、手提式電熱壓力蒸汽消毒器、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子分析天平、振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺、真空干燥箱、微量移液器．

1.2 方 法

采用微量肉湯稀釋法，先測定左氧氟沙星、加替沙星等10種抗菌藥對產ESBLs雞大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC），再分別測定這些藥物與舒巴坦鈉、EDTA以及舒巴坦鈉+EDTA聯用的MIC．藥物與舒巴坦鈉的質量比為 2∶1，EDTA濃度為1/2MIC．標準菌株ATCC25922作為質控菌．耐藥臨界值按CLSI頒布的數值標準[10-11]判定．

2 結果與分析

10種抗菌藥物及其與舒巴坦鈉、EDTA、舒巴坦鈉+EDTA聯用對18株產ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性見表1、表2．

表1 10種抗菌藥及其與舒巴坦鈉聯用對18株產ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of 10 antimicrobial drugs alone and in combination with sulbactam on 18 ESBLs-producing isolates from fowl E. coli

續(xù)表

從表1可以看出，18株產ESBLs雞大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率均達到 100%，加入舒巴坦鈉后耐藥率沒有變化；對第三代頭孢菌素類（頭孢噻呋、頭孢噻肟）的耐藥率也較高，但加入舒巴坦鈉后，對頭孢噻肟的耐藥率變?yōu)?0；對氟苯尼考、阿米卡星、磷霉素的耐藥率達到100%，加入舒巴坦鈉后都有所降低，對磷霉素的耐藥率變?yōu)?；對多西環(huán)素的耐藥率在加入舒巴坦鈉前后沒有明顯變化．

表2 10種抗菌藥分別與EDTA、EDTA+舒巴坦鈉聯用對18株產ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性Table 2 Antibacterial activity of 10 antimicrobial combinations with EDTA and sulbactam+EDTA against 18 ESBLs-producing isolates from fowl E. coli

從表2可以看出，18株產ESBLs的雞大腸桿菌對加入EDTA加替沙星的耐藥率降至30%，但對加替沙星+EDTA+舒巴坦鈉、環(huán)丙沙星+EDTA+舒巴坦鈉的耐藥率，與對加替沙星+EDTA、環(huán)丙沙星+EDTA的耐藥率無差異．

綜合分析表1、表2可知，對加入EDTA的頭孢噻呋的耐藥率與對頭孢噻呋單用的耐藥率沒有變化，但對第三代頭孢菌素類+EDTA+舒巴坦鈉的耐藥率比對第三代頭孢菌素類僅與EDTA或舒巴坦鈉聯用的耐藥率有所降低；對加入EDTA的多西環(huán)素、氟苯尼考、阿米卡星的耐藥率均比對單藥的耐藥率低，對氟苯尼考、阿米卡星、多西環(huán)素分別與EDTA+舒巴坦鈉聯用的耐藥率均比僅與EDTA或舒巴坦鈉聯用的耐藥率低．

3 結論與討論

本試驗檢測的產ESBLs雞大腸桿菌均呈多重耐藥特性，一是因為雞大腸桿菌攜帶ESBLs的質粒同時攜帶有氟喹諾酮類、氨基糖苷類等多種抗菌藥的耐藥基因，使產ESBLs菌具有多重耐藥表型[4]，二是因為產生ESBLs等特異性耐藥機制和外膜通透性降低、主動外排作用等非特異性耐藥機制協同存在導致了多重耐藥．舒巴坦鈉與β-內酰胺類抗生素聯用能明顯提高對產酶耐藥菌的體外抗菌活性[5]．本試驗結果表明，舒巴坦鈉不僅能增強第三代頭孢菌素類抗生素對產ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性，而且能明顯提高阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素的抗菌活性．其原因可能是舒巴坦鈉本身對產ESBLs菌有一定的內在活性，或當用舒巴坦鈉抑制ESBLs后，膜通透性改變，主動外排的作用亦相應減弱，從而在細菌細胞內的藥物濃度增加，使這3種藥物對產ESBLs雞大腸桿菌的抗菌活性相應增強，其具體分子機制有待研究．

本試驗結果表明，氟喹諾酮類、頭孢噻肟、多西環(huán)素、氟苯尼考、阿米卡星、磷霉素加入EDTA后對產ESBLs雞大腸桿菌的MIC降低，部分菌株可恢復敏感性．大多抗菌藥物，如β-內酰胺類、氯霉素、磷霉素、氨基糖苷類藥物，均主要通過大腸桿菌外膜蛋白（OmpF和OmpC，主要是OmpF）進入細胞內發(fā)揮抗菌作用[12]．文獻[13]報道，EDTA作為一種常見的膜通透性促進劑，可以與維持細胞膜結構和功能的必需成分Ca2+、Mg2+等絡合，從而導致細胞流動性和通透性增加，最終結果是增加藥物進入細菌的濃度，以對抗外膜滲透性降低及藥物外排泵出增強的多重耐藥機制．文獻[9]報道，在各抗菌藥物中加入EDTA可治療多重耐藥細菌感染．在本試驗中觀察到，在抗菌藥物中加入 EDTA使產ESBLs的多重耐藥菌對多數抗菌藥恢復了敏感性，說明EDTA與抗菌藥聯用，對控制多重耐藥菌感染有應用價值．

本試驗結果表明，第三代頭孢菌素、阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素與舒巴坦鈉+EDTA聯用的MIC，均比與舒巴坦鈉、EDTA聯用的MIC有所下降．這表明，β-內酰胺酶抑制劑舒巴坦鈉與膜通透性促進劑EDTA聯用，不僅對提高β-內酰胺環(huán)類藥物的抗菌活性有協同作用，而且對提高阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素的抗菌活性有協同作用，從而進一步從表型上證明了特異性耐藥機制產生 ESBLs與非特異性耐藥機制膜通透性降低在產 ESBLs禽大腸桿菌多重耐藥中有協同作用．據本試驗結果推測，舒巴坦鈉+EDTA與第三代頭孢、阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素等聯用，可能在產ESBLs多重耐藥禽大腸桿菌的防治上有應用前景．

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英文編輯：羅文翠