柑橘葉片蛋白質(zhì)高效提取與潰瘍病PthA蛋白質(zhì)Western blot分析

李娜，覃磊，嚴(yán)佳文，陳佩，鄧子牛*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128; 2.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128）

柑橘葉片中蛋白質(zhì)含量低，所含有的鹽、有機(jī)酸、色素、酚、多糖等物質(zhì)干擾蛋白質(zhì)樣品的制備．柑橘潰瘍?。–itrusbacterial canker disease）是一種世界性的檢疫性病害，病原基因pthA是致病所必需的因子[1]．筆者前期以柑橘潰瘍病致病基因pthA為出發(fā)點(diǎn)，利用病原基因誘導(dǎo)植物獲得抗性原理，已將致病基因pthA的核定位信號NLSs導(dǎo)入感病甜橙中．筆者研究柑橘葉片蛋白質(zhì)的提取，旨在建立一套適合SDS-PAGE電泳、質(zhì)譜分析和Western blot的蛋白質(zhì)提取方法；對柑橘潰瘍病致病基因pthA誘導(dǎo)表達(dá)的PthA進(jìn)行Western blot分析，將致病基因pthA導(dǎo)入甜橙中，使表達(dá)蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)活性，為PthA抗病機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為普通糖橙、普通冰糖橙、轉(zhuǎn)pthA-nls基因糖橙和轉(zhuǎn)pthA-nls基因冰糖橙的葉片，均采自國家柑橘改良中心長沙分中心溫室．抗PthA-NLS多肽單克隆抗體由湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體、增強(qiáng)型辣根過氧化物酶底物顯色試劑盒（HRP-DAB）購自天根生化科技北京有限公司．勻漿機(jī)為德國IKA公司生產(chǎn)的T10，電泳設(shè)備為美國GE公司生產(chǎn)，轉(zhuǎn)印設(shè)備為美國伯樂公司生產(chǎn)．MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀及相關(guān)軟件均為德國布魯克·道爾頓公司生產(chǎn)．

1.2 方 法

1.2.1 柑橘葉片蛋白質(zhì)的提取

（1） 用改良PBS法提?。簩en等[2]報(bào)道的方法進(jìn)行優(yōu)化．取葉片約0.5 g，洗凈，加入液氮研磨成粉末后加入10 mL離心管中，立即加入3 mL PBS （NaCl 137 mmoL/L，KCl 2.7 mmoL/L，Na2HPO410 mmoL/L，KH2PO41.76 mmoL/L，pH 7.4），混勻，在冰水混合物中勻漿，離心（9 500 g，15 min，4 ℃），取上清液，超聲破碎（開8 s，停5 s，共3 min），離心（12 000g，15 min，4 ℃），取上清液．

（2） 用Tris-HCl法[3-5]提?。?/p>

（3） 用三氯乙酸-丙酮法[6-7]提?。?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定

用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行定量，含考馬斯亮蘭G-250染色液和牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，測定595 nm波長下的吸光值，以不含BSA的樣品為空白對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量．

1.2.3 鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳

12%分離膠及5%濃縮膠制備參照文獻(xiàn)[8]．將樣品置于5×凝膠加樣緩沖液中，100 ℃加熱5 min，以使蛋白質(zhì)變性．等量加樣，重復(fù)，同時(shí)200 V等壓SDS-PAGE電泳．電泳結(jié)束后另一塊膠考馬斯亮蘭染色（0.1%考馬斯亮蘭R-250，50%甲醇，10%冰醋酸，40%蒸餾水）1 h，脫色（5%甲醇，7%冰醋酸，88%蒸餾水）2 h．膠片燈上觀察，拍照．

1.2.4 質(zhì)譜鑒定

用 MALDI TOF/TOF 進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過Mascot查詢NCBI 數(shù)據(jù)庫，如果Mascot 分?jǐn)?shù)高于66分（P＜ 0.05） 則認(rèn)為得到陽性鑒定，分?jǐn)?shù)越大匹配程度越高，否則視為未得到鑒定．將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶切下，膠內(nèi)酶解，將酶解產(chǎn)物濃縮后點(diǎn)于Anchorchip 樣品靶上，與 α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA） 共結(jié)晶，室溫干燥后，用MALDI TOF/TOF進(jìn)行鑒定，獲得的質(zhì)譜圖經(jīng)軟件Flex Analysis 3.0分析后，用Biotools 3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索.

1.2.5 潰瘍病PthA蛋白質(zhì)的Western blot分析

從轉(zhuǎn)pthA-nls基因冰糖橙、轉(zhuǎn)pthA-nls基因糖橙和未轉(zhuǎn)化普通冰糖橙、普通糖橙葉片中提取可溶性總蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜進(jìn)行Western印跡雜交．將凝膠、濾紙、0.45 μL硝酸纖維素膜（NC）置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中，浸泡15 min后，恒壓100 V在1 L含20%甲醛電極緩沖液中轉(zhuǎn)移90 min，將NC膜置于封閉液中封閉．漂洗，加入相應(yīng)的抗PthA-NLS多肽單克隆抗體（1∶1 000稀釋）[9-10]孵育，洗滌．加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體，室溫下于搖床孵育，洗滌，用HRP-DAB試劑盒在室溫下染色8 min，顯色后拍照．

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取柑橘葉片蛋白質(zhì)的效果

利用三氯乙酸-丙酮法、Tris-HCl提取法、改良的PBS法對0.5 g柑橘葉片進(jìn)行了蛋白質(zhì)提取，并對得到的蛋白質(zhì)液的濃度、體積、技術(shù)繁瑣程度進(jìn)行比較（表1）．

表 1 不同方法提取柑橘葉片蛋白質(zhì)的效果Table 1 Results comparison in different protein extraction methods

從表1可以看出，3種方法提取的蛋白質(zhì)效果及電泳結(jié)果差異較大，其中以改良PBS法的效果最好．用該方法提取的蛋白質(zhì)液濃度較高，量多，能滿足平行試驗(yàn)需要，而且技術(shù)操作簡單，費(fèi)時(shí)少，所需試劑少，成本低，所用試劑比使用丙酮、三氯乙酸等有機(jī)溶劑環(huán)保、無公害，有利于試驗(yàn)操作者的身體健康．

2.2 不同方法提取蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖1結(jié)果表明，1～2泳道帶型模糊，蛋白質(zhì)濃度低；3～4泳道背景較深，蛋白質(zhì)濃度較低；5～8泳道帶型清晰可見．

圖 1 不同方法提取蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE results of different extraction methods

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

在鑒定的2個(gè)特異性蛋白質(zhì)條帶中，Mascot得分分別為400和177，說明結(jié)果準(zhǔn)確可靠．鑒定結(jié)果見表2，與已報(bào)道的柑橘屬已知蛋白質(zhì)匹配，表明經(jīng)SDS-PAGE電泳分離的目的蛋白質(zhì)已達(dá)到質(zhì)譜對樣品的要求．

表 2 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 2 Proteins identified by MALDⅠ TOF/TOF

2.4 潰瘍病PthA蛋白質(zhì)的Western blot分析結(jié)果

圖2結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pthA-nls基因冰糖橙、轉(zhuǎn)pthA-nls基因糖橙在相對分子質(zhì)量48 000處呈陽性免疫性反應(yīng)，與陽性對照（PthA重組蛋白質(zhì)）一致，而未轉(zhuǎn)化普通冰糖橙、普通糖橙無條帶，說明pthA-nls基因已整合進(jìn)甜橙基因組并獲得表達(dá)，表達(dá)蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)活性．

圖2 潰瘍病PthA蛋白質(zhì)的Western blot分析結(jié)果Fig.2 Western blot results of transgenic pthA-nls plants

3 結(jié)論與討論

提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量直接關(guān)系到Western blot及后續(xù)其他蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)的成?。畟鹘y(tǒng)的三氯乙酸-丙酮法[11]是很有效的蛋白質(zhì)沉淀方法，能夠消除瞬時(shí)的蛋白質(zhì)水解作用和其他蛋白質(zhì)酶的修飾，其最大的缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)很難重新溶解，步驟較繁瑣，耗時(shí)較多．Tris-HCl提取法經(jīng)丙酮反復(fù)清洗，雖能較好地脫去鹽離子[12]，但損失較大，所得蛋白質(zhì)條帶數(shù)少．改良PBS法在試驗(yàn)中加以超聲波處理，使混合液均勻，大大增加了與提取液的接觸面積[13]，進(jìn)而提高了蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量．該技術(shù)操作簡單，適合柑橘葉片蛋白質(zhì)的提取，且提取的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳可得到帶型清晰、表達(dá)量較高的目的條帶，并可直接用于質(zhì)譜鑒定．

柑橘潰瘍病致病基因pthA是亞洲型（A型）病菌引發(fā)病癥所必需的因子．pthA基因位于柑橘潰瘍病菌大質(zhì)粒上，Swarup[14]在1991年克隆得到pthA基因全長，共有4 275 bp，編碼1 163個(gè)氨基酸殘基，其中核定位信號區(qū)（NLSS）是致病基因pthA的重要功能區(qū)和識別定位于寄主細(xì)胞的關(guān)鍵部位．點(diǎn)突變核定位信號區(qū)不能對柑橘誘發(fā)潰瘍病，但對非寄主植物土豆能誘發(fā)病癥，說明核定位信號是柑橘潰瘍病的致病關(guān)鍵因素，阻止其發(fā)揮功能，就有可能實(shí)現(xiàn)抗?。捌谝褜thA-nls基因轉(zhuǎn)入感病品種糖橙和冰糖橙中，希望阻斷其致病途徑，從而實(shí)現(xiàn)抗病；或者使致病基因pthA的核定位信號NLSs在甜橙中過量表達(dá)，使原有致病蛋白質(zhì)失去功能，或表達(dá)蛋白質(zhì)失去原有的時(shí)空性，或表達(dá)蛋白質(zhì)激活甜橙本身的防御系統(tǒng)，從而干擾病原菌的正常生理代謝，以致轉(zhuǎn)基因甜橙表現(xiàn)出抗性．本研究結(jié)果證實(shí)了pthA-nls基因已整合進(jìn)甜橙基因組并獲得表達(dá)，表達(dá)蛋白質(zhì)具有免疫反應(yīng)活性，為進(jìn)一步研究PthA的抗病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)．

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英文編輯：羅文翠