草魚腸道組織抑制性消減表達(dá)序列標(biāo)簽的初步分析

章卓，雷紅宇，蘇建明*

（1.全國(guó)畜牧總站，北京 100125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

魚類是最早兼有特異性免疫與非特異性免疫的脊椎動(dòng)物，由于其特異性免疫還不完善，抗體生成又受到水溫等多種環(huán)境因素的影響，因此非特異性免疫以其反應(yīng)快速、具有抗病作用而成為魚類抵抗病原入侵的第一道防線[1]．哺乳動(dòng)物黏膜免疫研究日前已備受重視[2]，而對(duì)魚類的免疫學(xué)研究目前大多集中在系統(tǒng)免疫上，對(duì)黏膜免疫的研究還不夠深入[3]．腸道存在多種常駐菌群．腸道在與這些微生物共存的同時(shí)，也可對(duì)存在的有害微生物或被腸道吸附的異己物質(zhì)進(jìn)行有效的識(shí)別，并加以排除．在感染情況下，腸上皮細(xì)胞可表達(dá)共刺激分子I-CAM-1，并通過MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子將抗原提呈給CD類型T細(xì)胞，引起免疫反應(yīng)[4]．在魚類腸道沒有類似哺乳動(dòng)物的Peyer氏淋巴結(jié)，可能影響對(duì)抗原的攝取與提呈[1]．目前，以腸道組織為材料，探討其在外界抗原誘導(dǎo)下表達(dá)基因的研究較少．筆者采用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了草魚腸道組織抑制性消減cDNA文庫(kù)，獲得了一定數(shù)量的草魚腸道組織差異表達(dá)的EST序列，并對(duì)獲得的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下．

1 材料與方法

1.1 材 料

供試草魚4條，體長(zhǎng)（20.4±1.8） cm．2條經(jīng)嗜水氣單胞菌灌服誘導(dǎo)，2 d后取腸道組織，用DEPC水處理的無(wú)菌水清洗3次，用于感染組消減文庫(kù)構(gòu)建；另2條不進(jìn)行感染處理，同樣取出腸道組織用作對(duì)照．

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取

按照總RNA提取試劑盒Trizol（Invitrogen）說明書操作，分別從感染組和對(duì)照組的腸道組織中提取總RNA；提取的總RNA用PolyATract mRNA Isolation System（Promega）試劑盒進(jìn)行mRNA分離純化．

1.2.2 消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

以感染組腸道組織作為檢測(cè)子樣品，以對(duì)照組腸道組織作為驅(qū)動(dòng)子樣品，參考PCR-select cDNA Subtraction Kit（Clontech）的操作手冊(cè)進(jìn)行差減雜交[5]．

1.2.3 文庫(kù)的篩選以及序列分析

圖 1 插入cDNA片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 PCR products electrophoresis of the inserted cDNA fragments

隨機(jī)挑取24個(gè)克隆，利用載體引物M13+ （5′-GTTGTAAAACGACGGCCAGTG-3′）和M13－（5′-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定cDNA插入片段的長(zhǎng)度；采用同樣的方法篩選cDNA克隆，片段長(zhǎng)度大于300 bp的用于測(cè)序．隨機(jī)挑取PCR篩選后的克隆，37 ℃液體培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒（Qiagene）．利用載體引物M13+/－為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成．采用DNAMAN序列分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果原始序列進(jìn)行分析，去掉兩端的載體序列以及難以辨認(rèn)的核苷酸，個(gè)別堿基通過軟件Chromas與原始序列文件比對(duì)進(jìn)行更正．

測(cè)序結(jié)果用Blast在GenBank中進(jìn)行同源性搜索比對(duì)分析，E值小于－6時(shí)認(rèn)為具有較好的同源性[6]．搜索順序依次為 BlastX （the nonredundant protein library，非重復(fù)蛋白質(zhì)文庫(kù)）、BlastN（the nonredundant nucleotide library，非重復(fù)核酸文庫(kù)）[7]，并根據(jù)其對(duì)應(yīng)的同源物對(duì)其進(jìn)行注釋和歸類分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)消減文庫(kù)質(zhì)量

對(duì)隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果（圖1）顯示克隆片段為0.25～1.50 kb．隨機(jī)挑選的24個(gè)克隆插入片段平均長(zhǎng)度為0.75 kb，最短的為0.25 kb，最長(zhǎng)的為1.5 kb，與文庫(kù)構(gòu)建經(jīng)第2次PCR檢測(cè)的預(yù)期結(jié)果相一致，構(gòu)建的消減cDNA文庫(kù)質(zhì)量較好．

2.2 消減cDNA EST序列的統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)211個(gè)克隆中的cDNA進(jìn)行單向測(cè)序, 除去測(cè)序效果不好、堿基無(wú)法辨認(rèn)或序列測(cè)序片段小于150 bp的序列，實(shí)際共獲得147個(gè)序列EST（非rRNA和chondriogene序列測(cè)序的錯(cuò)誤率小于5%）．相似性搜索結(jié)果表明，有97個(gè)克隆和GenBank中的已知功能的序列具有較高的同源性（分值＞100）；17個(gè)與未知功能的開放閱讀框具有較高的相似性，稱之為假定蛋白；33個(gè)序列在同源性搜索中沒有找到任何對(duì)應(yīng)的相似序列，它們很可能是目前還沒有鑒定的EST或是5′-或3′-UTR序列．

2.3 消減cDNA EST功能分類

根據(jù) Ademas等[8]對(duì)人類功能基因的分類方法，將獲得的EST 序列按BLAST得到的相似性序列功能進(jìn)行分類，結(jié)果見表1、表2．97個(gè)已知功能的 EST分別屬于46個(gè)不同的基因．在獲得的已知功能EST序列中，與細(xì)胞防御和基因表達(dá)有關(guān)的蛋白分別占EST簇?cái)?shù)的28.26%、19.57%；與代謝和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的蛋白分別占EST簇?cái)?shù)的23.91%、19.57%．和細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂有關(guān)的基因分別只有3、1個(gè)，EST簇?cái)?shù)也分別只有3、1個(gè)．

表 1 與GenBank中編碼已知功能蛋白質(zhì)和假定蛋白質(zhì)序列有同源性的草魚ESTTable 1 Grass carp ESTs matched to sequences encoding for known function protein and putative protein in GenBank datbase

續(xù)表

表2 編碼已知蛋白表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）的功能分類Table 2 functional categories of ESTs encoding known proteins

3 討 論

目前，已針對(duì)牙鲆[9-12]、鯰魚[13]、虹鱒[14]、鯉魚[15]、草魚[16]和扇貝[17]等，采用抑制消減雜交技術(shù)開展了相關(guān)基因的克隆與表達(dá)，獲得了許多發(fā)育、代謝及免疫的相關(guān)基因．筆者采用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了人工感染致病性細(xì)菌后草魚腸道組織差異表達(dá)的cDNA文庫(kù)．在獲得的EST序列中，與細(xì)胞防御相關(guān)基因的EST最多，表明在細(xì)菌誘導(dǎo)下，機(jī)體產(chǎn)生了免疫反應(yīng)過程，經(jīng)Blast分析獲得多個(gè)免疫抗病相關(guān)基因，如MHC、transferrin、CD9、AMBP、Crystallin等[18-19]．MHC參與免疫反應(yīng)過程對(duì)抗原的識(shí)別沒有特異性，屬于機(jī)體免疫系統(tǒng)的非特異性免疫體系．相對(duì)高等脊椎動(dòng)物，作為低等脊椎動(dòng)物的魚類，其特異性防御機(jī)制并不完善，魚類的非特異性免疫系統(tǒng)在其自身抗病作用中較特異性免疫系統(tǒng)可能發(fā)揮了更大的作用．除了MHC之外，轉(zhuǎn)鐵蛋白獲得4個(gè)克隆[20]．鐵蛋白對(duì)由應(yīng)激、化學(xué)物質(zhì)（尿素、鹽酸胍）引起的變性有很強(qiáng)的抵抗力[21]．新基因α-1微球蛋白/bikunin前體主要在肝臟中表達(dá)，后分離成α-1微球蛋白和胰蛋白酶抑制劑-bikunin．α-1微球蛋白在動(dòng)物體內(nèi)分布較廣，在人體內(nèi)參與了免疫調(diào)節(jié)作用[22]，但其確切的生理功能和發(fā)生機(jī)制還不清楚．試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn) 1個(gè)Z-Crystallin基因，屬于 Crystallin家族蛋白．對(duì)Crystallin蛋白的研究[23]表明，α、β-Crystallin蛋白為小分子伴侶蛋白，在老化進(jìn)程、應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用．Z-Crystallin是種NADPH氧化還原酶，與乙醇脫氫酶序列類似，但無(wú)乙醇脫氫酶活性，廣泛參與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，說明草魚在細(xì)菌的誘導(dǎo)下，機(jī)體在啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)的同時(shí)，也加強(qiáng)了自身代謝與基因表達(dá)的適應(yīng)性反應(yīng)[24]．

本研究中，通過抑制性消減雜交技術(shù)獲得了一定數(shù)量的差異表達(dá)基因．由于測(cè)定的cDNA數(shù)目有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞表達(dá)的基因數(shù)，但也初步反映了草魚腸道組織在病原菌的誘導(dǎo)下機(jī)體對(duì)外來刺激反應(yīng)的基因表達(dá)分布，獲得了不少新基因，特別是與免疫作用有關(guān)的基因的鑒定．研究這些基因的功能將為魚類黏膜分子免疫機(jī)制研究打下重要的信息基礎(chǔ)．

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英文編輯：羅文翠