人參皂苷保護小鼠精原細胞氧化損傷的研究

張大雷，楊 蓓，吳 磊，鄒 挺

(南昌大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，江西南昌 330006)

人參皂苷(Ginsenosides，GS)是人參的主要生物活性成分，具有增強免疫力、保護心血管系統、保護神經系統、抗衰老、抗癌等多種藥理學作用［1－4］。我們以前的研究表明GS可通過PKC介導的信號途徑促進小鼠精原細胞的增殖［5］。然而精子發(fā)生的生理過程受到多種外源因素的調控，其中過多的活性氧能夠導致生殖細胞氧化損傷，破壞精子質膜的流動性，引起DNA損傷和精子發(fā)生異常，從而使生精功能受損及精子質量下降，并進一步引起胚胎發(fā)育損傷［6－7］。本實驗利用小鼠生殖細胞－體細胞無血清共培養(yǎng)模型和活性氧系統次黃嘌呤(hypoxanthine，HX)/黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)研究GS對小鼠精原細胞氧化損傷的緩解作用，為男性生殖健康保護探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 生殖細胞分離和培養(yǎng)ICR乳鼠由南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號:0319602。頸椎脫臼法處死出生后6 d的小鼠，分離曲細精管，經磷酸鹽緩沖液(PBS)和培養(yǎng)液清洗，將組織剪碎，用1 g·L－1膠原酶(Gibco-BRL)消化2次后過濾，培養(yǎng)液離心洗滌細胞3次后經臺盼藍染料排除法計算細胞活率。細胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，其中添加 1.75 mmol·L－1Hepes、2 mmol·L－1谷氨酰胺、10 mg·L－1胰島素、5 mg·L－1轉鐵蛋白和 0.03 μmol·L－1亞硒酸鈉(Sigma)。

1.2 藥物處理在生殖細胞培養(yǎng)的同時加入GS(0.1 ～10 mg·L－1)和 HX/XO(10 μmol·L－1，2.5 IU·L－1)單獨或聯合處理。對照組僅添加培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱。每個處理4孔，實驗重復3次。

1.3 細胞活性檢測采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定生殖細胞活性。細胞培養(yǎng)24 h后，加入MTT(最終濃度為0.25 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸除培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的DMSO溶解紫色顆粒，用酶標儀測570 nm下的吸光度值，并計算細胞存活率。

1.4 細胞形態(tài)觀察在倒置相差顯微鏡(Olympus，TX100)下觀察細胞生長和形態(tài)變化。細胞培養(yǎng)24 h后，用顯微數字成像系統(Pixera Pro 150ES)拍照。

1.5 MDA生成、SOD活性和GSH含量檢測細胞培養(yǎng)24 h后，采用硫代巴比妥酸法測定培養(yǎng)液中MDA的生成量;采用黃嘌呤氧化酶法測定細胞內SOD活性;采用二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH含量。使用MDA、SOD和GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所)，操作過程按照說明書進行。

1.6 數據分析所得數據用±s表示，采用SAS 6.12軟件中GLM過程進行方差分析及Duncan's多重分析比較。

2 結果

2.1 GS和HX/XO對精原細胞存活的影響生殖細胞培養(yǎng)24 h后，與對照組相比，HX/XO明顯抑制了精原細胞的生長，細胞活性明顯降低(P＜0.05)，而GS(10 mg·L－1)可促進精原細胞的生長(P＜0.05)。此外，GS(10 mg·L－1)可緩解HX/XO引起的細胞生長抑制(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effects of GS and HX/XO on spermatogonial viability(±s，n=4)

2.2 GS和HX/XO處理后精原細胞的形態(tài)變化與對照組相比，HX/XO對生殖細胞產生明顯的細胞毒性作用，細胞呈現空泡化并出現死亡，大量的細胞碎片釋放到培養(yǎng)液中，貼壁的生殖細胞數目減少。GS(10 mg·L－1)緩解了HX/XO系統引起的細胞氧化損傷，細胞形態(tài)完整，貼壁的生殖細胞數目增多，見Fig 2。

Fig 2 Morphological changes of mouse testicular germ cells after treatments of chemicals for 24 h

2.3 GS對HX/XO系統引起的精原細胞氧化損傷的保護作用HX/XO對精原細胞具有明顯的氧化損傷作用，與對照組相比，HX/XO處理組的MDA生成升高，SOD活性和GSH水平下降(P＜0.05)。然而，GS(10 mg·L－1)可明顯緩解HX/XO引起的細胞氧化損傷，MDA濃度明顯降低，而SOD活性和GSH水平明顯升高(P＜0.05)，見Fig 3。

Fig 3 Determination of attenuating effects of GS on germ cell oxidative damage by MDA formation，SOD activity(B)and GSH level(C)(±s，n=4)

3 討論

哺乳動物睪丸生殖細胞對細胞內外的氧化狀態(tài)高度敏感，極易受到自由基的損傷。SOD和GSH是細胞內消除活性氧的抗氧化防御體系，能夠清除自由基，減少細胞內過氧化物的生成，從而防止細胞受到氧化損傷。MDA可以反映脂質過氧化損傷的程度。本實驗的結果表明HX/XO處理后通過產生活性氧破壞生殖細胞的完整性，使脂質過氧化產物MDA的生成量增加，引起SOD活性和GSH水平降低，從而破壞細胞內的抗氧化酶防御系統，導致小鼠精原細胞氧化損傷。

GS具有明顯的抗氧化作用，可通過抑制氧自由基的過度產生減輕由缺血/再灌注引起的組織損傷［8］，并提高膽堿能系統的抗氧化能力從而改善老齡大鼠的認知能力［9］。許立等［10］的研究也表明GS可增強睪丸組織的抗氧化能力，從而對♂小鼠生殖功能具有保護和改善作用。本實驗的結果表明GS能夠使精原細胞內SOD活性和GSH水平以及MDA的生成量恢復到正常水平，說明GS可以通過抗氧化作用阻止生殖細胞的脂質過氧化和清除自由基并維持正常的抗氧化體系，進而保護活性氧引起的生殖細胞氧化損傷。

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