PRKAA2基因多態(tài)性與二甲雙胍療效的相關(guān)性研究

李建娥，蘭 怡，李琳琳，白旭東，毛新民，3

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830054;2.新疆烏魯木齊市友誼醫(yī)院干部病房，新疆 烏魯木齊 830049;3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院糖尿病VIP實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830054)

近年來腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)已成為2型糖尿病(T2DM)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，AMPK已經(jīng)被看作是T2DM治療的潛在的藥理作用靶點(diǎn)［1－2］。二甲雙胍作為T2DM治療的一線藥物，在糖尿病治療的臨床實(shí)踐中表現(xiàn)出良好的降糖效果，并有改善胰島素敏感性、調(diào)節(jié)脂肪代謝等作用。大量實(shí)驗(yàn)表明，二甲雙胍可通過部分途徑激活肌肉和肝臟中的AMPK，使其活化，調(diào)節(jié)葡萄糖和和脂質(zhì)代謝，改善胰島素敏感性［3－6］。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明［7］，超過36%的糖尿病患者服用二甲雙胍后達(dá)不到預(yù)期的空腹血糖控制目標(biāo)，即存在用藥個(gè)體差異性，由此我們假設(shè)這種用藥個(gè)體差異性可能與編碼AMPKα2亞基的基因PRKAA2的變異有關(guān)。本文旨在了解T2DM患者服用二甲雙胍的療效與PRKAA2基因多態(tài)性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 樣本來源 新疆烏魯木齊市友誼醫(yī)院、第二濟(jì)困醫(yī)院以及喀什東路社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站周圍社區(qū)被診斷為T2DM的患者共32人，男性19人，女性13人，年齡42～71歲。依據(jù)2006年WHO T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖≥7.0 mmol·L－1或餐后2 h血糖≥11.1 mmol·L－1。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)確診為T2DM的且未服用任何降糖藥物的患者直接納入研究范圍，若已接受過T2DM藥物治療的患者，在經(jīng)過5～7個(gè)藥物半衰期后可納入研究范圍。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 患有胃腸炎、潰瘍，腎功能不好的病人及偏瘦的病人;因腹瀉等副作用不能繼續(xù)服用二甲雙胍的病人;因其他原因中斷藥物干預(yù)的病人;干預(yù)過程中加入或改用其它藥物治療的病人。

1.1.4 藥物干預(yù)及血樣的采集 確診為T2DM的患者服用二甲雙胍干預(yù)1周，劑量為2 000 mg·d－1，服藥前、服藥1周后采血，分離血清，分別測(cè)定藥物干預(yù)前后的空腹血清血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、總膽固醇(total cholesterin，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterin，HDL-C)。

1.2 基因組DNA的提取EDTA-K2抗凝血約3 ml，常規(guī)酚/氯仿/異戊醇提取基因組DNA。

1.3 PCR引物及反應(yīng)條件利用Primer 5.0設(shè)計(jì)SNP1rs2051040和SNP2rs17848595兩對(duì)引物，并用Winmelt軟件分析確定GC夾子的位置，GC夾子均加在兩對(duì)引物上游引物的5'端。

PCR 反應(yīng)體系為25 μl，含雙蒸水9.5 μl，Master 12.5 μl，上下游引物各 0.5 μl(10 μmol·L－1)，DNA 模板 2.0 μl。反應(yīng)條件 94℃ 5 min，94℃ 30 s，T 30 s，72℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，兩個(gè)片段T值分別是58℃，61℃。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳、標(biāo)準(zhǔn)Marker和陰性對(duì)照鑒定。

1.4 DGGE檢測(cè)基因型檢測(cè)采用DCode通用突變檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。應(yīng)用軟件Winmelt對(duì)待測(cè)DNA序列進(jìn)行分析，根據(jù)解鏈溫度曲線確定電泳緩沖液溫度和變性劑梯度范圍。取7 μl PCR產(chǎn)物與7 μl上樣緩沖液混合，上樣于8%(35∶7)聚丙烯胺凝膠中，緩沖液溫度為60℃，變性劑濃度為15% ～30%、25% ～40%，150 V電壓，電泳4 h，EB染色。凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因型頻率及等位基因頻率，應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)兩組基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡。計(jì)量資料用±s表示，配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行治療前后的比較。上述數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR-DGGE電泳結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用酚氯仿法提取全血標(biāo)本的基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定，OD260nm/OD280nm均大于1.6，說明純度良好。利用聚合酶鏈反應(yīng)，按本文前述的反應(yīng)條件進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)過DGGE檢測(cè)基因突變，結(jié)果如Fig 1所示，每個(gè)樣本經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

2.2 SNP基因型及等位基因頻率分布根據(jù)DGGE電泳條帶對(duì)SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行判斷，計(jì)算各基因型及等位基因的頻率，結(jié)果Tab 1、2所示。rs20510403種基因型CC、CT、TT頻率在有效組中分別為56.5%、30.5%、13.0%，在無效組中分別為33.3%、44.5%、22.2%。rs17848595 3種基因型AA、AG、GG頻率在有效組中分別為 52.2%、34.8%、13.0%，在無效組中分別為 55.6%、33.3%、11.1%，rs2051040基因型頻率在有效組與無效組兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.36，P=0.003)，rs17848595基因型頻率在有效組與無效組兩組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.37，P=0.829)。兩SNP位點(diǎn)等位基因頻率分布在有效組與無效組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 1 Primer sequence

Fig 1 Parallel DGGE gel of PCR products

Tab 2-1 SNP rs2051040 genotype and allele frequency

Tab 2-2 SNP rs17848595 genotype and allele frequency

2.3 基因多態(tài)性與二甲雙胍療效的關(guān)系見Tab 3。T2DM患者經(jīng)過二甲雙胍治療1周后，rs2051040 C/C基因型的患者FPG、TG、TC、LDL-C指標(biāo)與治療前比較差異均有顯著性(P＜0.05)，C/T基因型的患者TG、TC、LDL-C指標(biāo)與治療前比較差異均有顯著性(P＜0.05)，T/T基因型的患者TG、TC指標(biāo)與治療前比較差異均有顯著性(P＜0.05)，各組HDLC在治療前后均沒有變化(P＞0.05)。rs17848595 A/A基因型的患者FPG、TG、TC、LDL-C指標(biāo)與治療前比較差異均有顯著性(P＜0.05)，A/G基因型的患者TC、LDL-C指標(biāo)與治療前比較均有差異(P＜0.05)，T/T基因型的患者上述指標(biāo)的變化沒有影響(P＞0.05)，各組HDL-C在治療前后均沒有變化(P＞0.05)。

3 討論

AMPKα2亞基主要存在于骨骼肌和肝臟中。在骨骼肌中激活A(yù)MPK可增加葡萄糖的攝取和胰島素的敏感性［8］，而在肝臟中激活A(yù)MPK會(huì)抑制葡萄糖的產(chǎn)生［9］。AMPKα1-/-小鼠沒有表現(xiàn)出代謝缺陷，而AMPKα2－/－小鼠卻呈現(xiàn)出高血糖和胰島素抵抗［10］。一些實(shí)驗(yàn)已證明α2催化亞基在降糖藥物二甲雙胍的刺激作用下被磷酸化［5，10－12］，進(jìn)一步激活A(yù)MPK產(chǎn)生一系列生理學(xué)效應(yīng)，說明α2催化亞基在AMPK活化過程中起關(guān)鍵作用。

α2亞基由 PRKAA2基因編碼，位于1p36-32上，是日本人T2DM圖譜位點(diǎn)之一，曾報(bào)道過這與日本人 T2DM 有關(guān)［13］。本研究選取 Horikoshi等［14］所做研究中提到的PRKAA2 rs2051040和第4外顯子區(qū)的rs17848595兩個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，旨在探討其是否與二甲雙胍用藥個(gè)體差異有關(guān)。

二甲雙胍干預(yù)1周后，據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，F(xiàn)PG降低10%為治療有效，血糖下降未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)的認(rèn)為治療無效。采用PCR-DGGE的方法對(duì)受試者的基因型頻率及等位基因頻率進(jìn)行分析，rs2051040位點(diǎn)基因型頻率分布及基因型構(gòu)成比在有效組與無效組之間有差異。攜帶野生型基因型患者的FPG、TG、TC、LDL-C指標(biāo)與治療前比較差異有顯著性(P＜0.05)。rs17848595基因型構(gòu)成比在有效組與無效組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是從其與二甲雙胍療效關(guān)系表中可以看出，突變型等位基因可能是影響其療效的因素，出現(xiàn)兩種不同結(jié)果的原因可能是樣本例數(shù)偏少，在按照療效分組時(shí)計(jì)算的基因構(gòu)成比可能與大樣本的基因型分布有一定差別，需要更多的樣本去驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論。本研究中，二甲雙胍調(diào)節(jié)血糖血脂的作用由于 α2亞基基因 PRKAA2的rs2051040和rs17848595位點(diǎn)突變而發(fā)生改變，可能是α2催化亞基的磷酸化作用受到影響，進(jìn)而影響了AMPK的活化，使二甲雙胍對(duì)攜帶不同基因型患者表現(xiàn)出不同的療效。

Tab 3 The relation of PRKAA2 genetic polymorphism and metformin response(mmol·L －1)

AMPK已被認(rèn)為是二甲雙胍治療T2DM的潛在藥理學(xué)靶點(diǎn)，PRKAA2基因rs2051040和rs17848595兩個(gè)位點(diǎn)SNP均可以影響二甲雙胍調(diào)節(jié)血糖、血脂的代謝水平，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了AMPK是二甲雙胍的靶點(diǎn)。本研究的結(jié)果只能說明 rs2051040和rs17848595位點(diǎn)的SNP與二甲雙胍用藥個(gè)體差異有關(guān)，與其它多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建單倍型是否與二甲雙胍用藥個(gè)體差異相關(guān)還有待進(jìn)一步篩查，以便為糖尿病治療學(xué)和藥物基因組學(xué)研究提供更多的線索。

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