華東地區(qū)6株不同年份的H9N2亞型禽流感病毒的遺傳進(jìn)化分析

裴宇茹，王曉泉,2，劉曉文,2，胡順林,2，顧 敏,2，胡 嬌,2，劉秀梵,2

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省重點(diǎn)動(dòng)物傳染病和人畜共患病預(yù)防控制聯(lián)合創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

1966年，H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）首次從美國(guó)威斯康辛州的火雞中分離出來(lái)[1]。在隨后的幾十年里，該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，常與其他病原體共感染，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量下降和死亡，給家禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1992年，在中國(guó)大陸的雞群中首次分離到H9N2亞型禽流感病毒，由于H9N2病毒對(duì)家禽為低致病性，在各類動(dòng)物疾病防控中處于較低級(jí)別，導(dǎo)致該病毒迅速在中國(guó)大陸多個(gè)不同地區(qū)廣泛傳播，成為雞、鴨、鵪鶉等禽類中最流行的禽流感病毒亞型[2]。已有文獻(xiàn)表明，宿主屏障在很大程度上限制了病毒在不同物種之間的傳播，但當(dāng)這些屏障被突破時(shí)，流感病毒可能會(huì)發(fā)生跨物種傳播，并造成嚴(yán)重后果，特別是在病毒從禽類宿主向哺乳動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化的過(guò)程[3]。此外，H9N2 AIV可以與哺乳動(dòng)物唾液酸受體結(jié)合。2013-2018年，出現(xiàn)了多個(gè)H9N2實(shí)驗(yàn)室確診病例[4]。最近的研究報(bào)道，H9N2病毒為中國(guó)南方新出現(xiàn)的H7N9病毒和在中國(guó)江西省造成3人感染的H10N8病毒貢獻(xiàn)了6個(gè)內(nèi)部基因[5-6]，這表明H9N2病毒給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅。本研究對(duì)我國(guó)華東地區(qū)2011-2019年分離的6株H9N2 AIV進(jìn)行了全基因組測(cè)序，通過(guò)分析遺傳進(jìn)化、受體結(jié)合特性和宿主適應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵分子標(biāo)記，探究近10年H9N2亞型AIV的遺傳進(jìn)化特點(diǎn)及跨種感染的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)毒株與材料 H9N2亞型禽流感毒株A/Chicken/Jiangsu/SQ68/2011(H9N2)（簡(jiǎn)稱SQ68/11）、A/Chicken/Jiangsu/TM118/2014(H9N2)（簡(jiǎn)稱TM118/14）、A/Chicken/Anhui/AH320/2016(H9N2)（簡(jiǎn)稱AH320/16）、A/Chicken/Anhui/AH463/2017(H9N2)（簡(jiǎn)稱AH463/17）、A/Chicken/Fujian/FJ1802/2018(H9N2)（簡(jiǎn)稱FJ1802/18）、A/Chicken/Anhui/NG1901/2019(H9N2)（簡(jiǎn)稱NG1901/19）由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室分離并保存。無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

樣品處理液為含有抗生素的pH7.0～7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）；各AIV HA亞型抗血清及新城疫病毒陽(yáng)性血清、1%雞紅細(xì)胞均由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室制備并提供；EasyPure Viral DNA/RNA Kit RNA提取試劑盒、DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶及反轉(zhuǎn)錄體系其他成分、DNA marker購(gòu)自購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Gel Extraction Kit膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；各亞型AIV通用反轉(zhuǎn)錄12 bp隨機(jī)引物5'-AGCAAAAGCAGG-3'、普通PCR引物合成和基因測(cè)序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 病毒RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)RNA提取試劑盒及提供的說(shuō)明書(shū)提取分離病毒RNA，根據(jù)相應(yīng)說(shuō)明書(shū)配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 分析近年來(lái)GenBank收錄的的H9N2 AIV 基因序列，運(yùn)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

表1 RT-PCR 擴(kuò)增 H9N2 禽流感病毒基因片段的引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences for amplifying genome of H9N2 Avian in fluenza virus

1.2.2 RT-PCR及電泳檢測(cè) 根據(jù)每對(duì)引物的Tm值，選擇相應(yīng)PCR反應(yīng)的退火溫度，設(shè)計(jì)反應(yīng)程序。經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，切取目的條帶，根據(jù)膠回收試劑盒做膠回收，將膠回收產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 處理分析序列 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和DNAStar、DNAMAN等軟件編輯處理測(cè)序公司反饋的序列，將基因序列保存為成FAS文件格式。從GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)下載H9N2 AIV標(biāo)準(zhǔn)參考株, 運(yùn)用MEGA6.0進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HA基因序列分析

2.1.1 HA基因遺傳進(jìn)化分析 對(duì)6株H9N2 AIV分離株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析表明，毒株HA基因開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）基因全長(zhǎng)1683 bp，無(wú)核苷酸插入或缺失，編碼560個(gè)氨基酸。6個(gè)毒株之間核苷酸同源性為90.1%～97.2%，氨基酸同源性為90.9%～98%，其中年份差距最遠(yuǎn)的兩株分離株SQ68/11與NG1901/19核苷酸和氨基酸同源性最低，說(shuō)明毒株隨時(shí)間演化存在遺傳差異。HA基因的同源性在8個(gè)片段中最低，說(shuō)明HA基因的遺傳進(jìn)化最為顯著。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，雖然2009年以來(lái)大部分H9分離株HA基因共同起源Y280/97，但是不同年代的毒株存在一定的遺傳距離，2009-2012年毒株單獨(dú)一個(gè)分支，2014年后的毒株分布在3個(gè)Group[7]，近5年分離株主要分布于Group 3，還有部分毒株分布于Group 2，具體見(jiàn)圖1。

2.1.2 HA關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 HA的序列分析顯示，其中5株分離毒株的裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為PSRSSR↓GLF，1株（A/Chicken/Anhui/AH463/2017(H9N2)）為PSRSNR↓GLF，均符合低致病性AIV的特征。HA的受體結(jié)合位點(diǎn)分析如表2所示（保守的受體結(jié)合位點(diǎn)不單獨(dú)列出），受體結(jié)合位點(diǎn)右側(cè)臂有3種氨基酸組成形式：GTSKA、GTSSA、GTSTA；受體結(jié)合位點(diǎn)左側(cè)臂除SQ68/11外，剩余5株均為NGLMGR。

表2 6株H9N2分離毒株HA基因的氨基酸位點(diǎn)分析Table 2 Amino acid site of HA of six H9N2 isolates

6株病毒在重要的受體結(jié)合位點(diǎn)處，均出現(xiàn)了Q226L的變化，在第155位氨基酸均為T[8]（全文均采用H3計(jì)數(shù)方法），除AH320/16外的5株病毒第183位受體結(jié)合位點(diǎn)為N[9]，除SQ68/11外5株病毒發(fā)生A190T/V的變化，這些均可以增強(qiáng)H9N2病毒對(duì)人源受體的親和力[10]，說(shuō)明6株H9N2禽流感病毒在遺傳進(jìn)化過(guò)程中已具有優(yōu)先與人源受體結(jié)合的能力。5株病毒（除SQ68/11外）發(fā)生了D210N的突變，可改變H9N2 AIV的抗原性，降低HA蛋白的酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，同時(shí)促進(jìn)H9N2病毒的復(fù)制[11]。

AIV HA蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)的改變可能會(huì)影響宿主免疫反應(yīng)[12-13]，從而導(dǎo)致病毒毒力的改變和免疫逃逸現(xiàn)象。本研究的6株病毒含有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別是21NST、128NVS、289NTT、296NVS、304NCS、483NGT、541NGS。其中早期毒株SQ68/11在210NRT、304位均存在潛在糖基化位點(diǎn)，即8個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)。但剩余5株分離毒的HA蛋白T212I的突變導(dǎo)致210位潛在糖基化位點(diǎn)的缺失，均在304位新增潛在的糖基化位點(diǎn)，符合H9N2 AIV變異的新特征[14]。

2.2 NA基因序列分析 6株H9N2 AIV分離毒NA基因的ORF全長(zhǎng)為1401 bp，編碼466個(gè)氨基酸，核苷酸同源性為90.7%～98.3%，氨基酸同源性為87.8%～98%，其中SQ68/11與NG1901/19核苷酸和氨基酸同源性最低。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示（圖1），分離株與參考株Y280/97距離較近，均劃為Y280-Like。其中6株分離毒分別聚類在2個(gè)Group，近兩年的分離株（AH320/16、AH463/17、FJ1802/18、NG1901/19）均位于Group A，年份較遠(yuǎn)的毒株（SQ68/11、TM118/14）主要分布于Group B，其他參考株均符合該規(guī)律，說(shuō)明NA基因在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)上存在明顯的隨時(shí)間演化特點(diǎn)，并且Group A在近兩年的NA基因進(jìn)化過(guò)程中占優(yōu)勢(shì)。分離毒與參考株Y280/97的核苷酸同源性為89.9%～95.4%，氨基酸同源性為87.8%～95.8%，其中SQ68/11與NG1901/19核苷酸和氨基酸同源性最低，F(xiàn)J1802/18與NG1901/19的核苷酸和氨基酸同源性最高，說(shuō)明基因隨著年代在不斷進(jìn)化。

圖1 6株分離毒HA、NA基因片段系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.1 Phylogenetic trees of HA and NA genes of the six H9N2 isolates

根據(jù)氨基酸序列分析，潛在糖基化位點(diǎn)有8個(gè)：44NPS、69NST、86NWS、146NGT、200NAT、234NGT、264NIS、368ND/GS（表3），其中44、264、368位潛在糖基化位點(diǎn)均有差異。AH320/16在第44位增加潛在糖基化位點(diǎn)；AH463/17、FJ1802/18、NG1901/19均在第264位發(fā)生潛在糖基化位點(diǎn)的缺失，但又與AH320/16在第368位均發(fā)生潛在糖基化位點(diǎn)的增加。另外，在紅細(xì)胞結(jié)合重要位點(diǎn)發(fā)生了E368S/N、D369G、S400N、N402S/D的突變，在活性中心2014年以后的毒株發(fā)生了I153T的突變（表3）。

表3 6株H9N2分離毒NA基因的潛在糖基化位點(diǎn)和功能位點(diǎn)分析Table 3 Potential glycation sites and function sites of NA gene of six H9N2 isolates

2.3 內(nèi)部基因的序列分析

2.3.1內(nèi)部基因遺傳進(jìn)化分析 對(duì)6株H9N2亞型分離毒的內(nèi)部基因片段分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖2），結(jié)果表明，內(nèi)部基因發(fā)生樹(shù)中PB2、PA、PB1和NS基因發(fā)生樹(shù)存在一個(gè)共同特點(diǎn)：即形成兩個(gè)分支，一個(gè)是2013年之前的毒株，以2011年毒株SQ68為代表；另一個(gè)是2013年之后的毒株形成的分支，并且隨著年代不同毒株在不斷演化出不同的小分支。PB2和PA基因發(fā)生樹(shù)中以AH463/17為代表的毒株聚類于一個(gè)小分支，AH463/17毒株與其他5株分離株的遺傳距離較遠(yuǎn)、核苷酸和氨基酸相似性略低：PB2核苷酸相似性為92.8%～95.3%，氨基酸相似性為98%～98.4%；PA核苷酸相似性為94.5%～96.4%，氨基酸相似性為97.7%～98.9%。M基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，以TM118/14為代表的2013-2014年毒株聚類于一個(gè)小分支，TM118/14與其他5株分離毒的遺傳距離較遠(yuǎn)，核苷酸相似性為96.2%～98.3%，氨基酸相似性為97.1%～98.1%；2012年以后的毒株（AH320/16、AH463/17、FJ1802/18和NG1901/19）聚在另一個(gè)分支且相互之間遺傳距離較近，均起源于SQ68/11-like毒株。NP基因與其他5個(gè)內(nèi)部基因不同的是，都是起源于F98-like，但是近幾年的毒株分為兩個(gè)分支，一個(gè)以AH463為代表的，包含2015-2018年的毒株；另一個(gè)分支包含2008-2019年的毒株，其中2013年以前與以后的毒株分在兩個(gè)不同的亞分支。

圖2 6株分離毒內(nèi)部基因片段系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.2 Phylogenetic trees of internal genes of the six H9N2 isolates

2.3.2 內(nèi)部基因關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析表明，本研究的6株H9N2亞型AIV分離毒在PB2蛋白并未發(fā)生E627K、N701D的突變，但6株分離毒株中有3株分離毒株（SQ68/11、AH320/16、FJ1802/18）發(fā)生I292V的突變；4株分離毒株（TM118/14、AH320/16、FJ1802/18、NG1901/19）發(fā)生A588V的突變，該突變可促進(jìn)H9N2病毒在哺乳動(dòng)物中的復(fù)制。6株分離毒株P(guān)A蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)分析顯示，除SQ68/11外，5株分離毒株（TM118/14、AH320/16、AH463/17、FJ1802/18 和NG1901/19）均發(fā)生了K356R的突變，提示H9N2病毒在哺乳動(dòng)物宿主適應(yīng)性增強(qiáng)；除FJ1802/18外，其余5株分離毒株（SQ68/11、TM118/14、AH320/16、AH463/17、和NG1901/19）均發(fā)生S409N的變化。此外，6株H9N2分離毒株具有一致的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸變異：M2蛋白第21位氨基酸均為G、第31位均為N以及NP蛋白第253位氨基酸均為I。

表4 6株H9N2分離毒株內(nèi)部基因的關(guān)鍵差異位點(diǎn)氨基酸分析Table 4 Key amino acid analysis in internal genes of six H9N2 isolates

3 討論

H9N2亞型禽流感病毒在世界許多地方的家禽中廣泛傳播，并且在我國(guó)已有20多年的歷史，它偶爾會(huì)跨越物種屏障引起人類感染。有證據(jù)表明，多個(gè)國(guó)家發(fā)生人感染H9N2禽流感病毒的病例，或血清學(xué)調(diào)查證明人感染或暴露H9N2病毒，這強(qiáng)調(diào)了H9N2亞型具有引起人類輕度和/或無(wú)癥狀感染的能力[15]。H9N2禽流感病毒之間存在廣泛的遺傳多樣性，目前已鑒定出100多種不同的基因型和幾個(gè)分散的譜系[16]。

本研究對(duì)華東地區(qū)6株不同年份（2011-2019年）的H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)行了全基因遺傳進(jìn)化分析，其中HA和NA基因的序列分析表明，本研究的6株分離毒均屬Y280-Like，但它們之間的核苷酸、氨基酸同源性均較低（核苷酸同源性最低為90.1%，氨基酸為90.9%），這說(shuō)明H9N2亞型AIV在免疫選擇壓力下發(fā)生了較大的基因變異。6株毒株的HA基因裂解位點(diǎn)均無(wú)多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸，符合低致病性毒株的特征，但HA蛋白第226位氨基酸為L(zhǎng)、第155位氨基酸為T，表明6株病毒具有感染人類的可能性。6株病毒均發(fā)生HA D210N的突變，可以促進(jìn)H9N2病毒的復(fù)制，372K可以促進(jìn)H9N2病毒的氣源性傳播能力，這些有利于病毒生存以及跨種間感染的位點(diǎn)變化應(yīng)該受到關(guān)注。

糖基化位點(diǎn)的分析顯示，6株毒株中均出現(xiàn)了HA蛋白210位潛在糖基化位點(diǎn)的缺失和304位的增加，此前有文獻(xiàn)報(bào)道，HA蛋白的第210位糖基化位點(diǎn)的缺失會(huì)降低病毒結(jié)合雞紅細(xì)胞的能力，提高病毒對(duì)雞胚的致死性[17]。NA蛋白63～65位氨基酸的缺失導(dǎo)致第61位糖基化位點(diǎn)的消失，這是目前S基因型H9N2毒株共有的特征。但我們的分析發(fā)現(xiàn)與Y280/97相比，6株分離株的NA蛋白還出現(xiàn)了第44位潛在糖基化位點(diǎn)的增加（AH320/16）、第264位和第368位潛在糖基化位點(diǎn)的變化（AH320/16、AH463/17、FJ1802/18、NG1901/19），并且這些變化均在近幾年的毒株中出現(xiàn)，表明H9N2亞型AIV病毒NA蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)具有一定持續(xù)進(jìn)化的趨勢(shì)。

除了H9N2 HA基因的受體結(jié)合偏好外，內(nèi)部基因組合在哺乳動(dòng)物的病毒傳播中也起決定作用。有研究報(bào)道，某些H9N2病毒內(nèi)部基因具有獨(dú)特的能力，可提高非H9N2 AIV的人畜共患病潛能，最近的例子包括H7N9、H10N8和H5N6[18]。已知的PB2-E627K和D701N的適應(yīng)性突變很少在流行的禽源H9N2病毒中發(fā)現(xiàn)，本研究的6株分離毒在這兩個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生突變。文獻(xiàn)報(bào)道，PB2蛋白A588V替代可能是AIV適應(yīng)哺乳動(dòng)物的新策略；PB2蛋白I292V的突變可作為一種新型的哺乳動(dòng)物適應(yīng)性標(biāo)記，促進(jìn)H9N2病毒在哺乳動(dòng)物宿主中的復(fù)制[19]。本研究的分離毒株除SQ68/11外均發(fā)生了PA蛋白K356R的突變，該位點(diǎn)是一種新的哺乳動(dòng)物向性突變，與PB2-E627K、PA-S409N等突變一起，可能使禽源H9N2病毒適應(yīng)人類感染，增加病毒在哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)的復(fù)制和致病性[20]。M2蛋白第31位S突變?yōu)镹該位點(diǎn)是流感病毒具有抗金剛烷類抗性的靶位點(diǎn)，以及21位氨基酸為G顯示出增強(qiáng)的病毒感染性；NP蛋白第253位氨基酸突變?yōu)镮導(dǎo)致病毒在哺乳動(dòng)物宿主中致病性的降低和宿主的向性變化[21]，6株分離毒均符合這3個(gè)特征。同時(shí)，它們均攜帶了幾種哺乳動(dòng)物適應(yīng)的分子殘基，包括PB1蛋白中的L13P、M1蛋白中的V15I、M2蛋白中的I28V、L55F和NS蛋白中的E227K[22]。6株病毒的內(nèi)部基因遺傳進(jìn)化分析顯示，H9N2亞型AIV病毒已攜帶多種哺乳動(dòng)物適應(yīng)性氨基酸位點(diǎn)的突變，這些哺乳動(dòng)物適應(yīng)標(biāo)記位點(diǎn)的突變，增加了H9N2造成大流行的風(fēng)險(xiǎn)。因此，提示加強(qiáng)持續(xù)監(jiān)測(cè)H9N2亞型AIV的重要性。

根據(jù)本研究中全基因組遺傳進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道H9N2亞型AIV基因型的劃分標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)6株分離毒株仍屬于中國(guó)H9N2亞型AIV的主要流行S基因型。該基因型自2007年首次被分離，至2010年進(jìn)化成了目前優(yōu)勢(shì)基因型[23]，6株分離株的年份分布于2011-2019年，說(shuō)明直至目前，華東地區(qū)家禽中的AIV感染依舊是以S基因型為主[24-25]。雖然不同年份的6株病毒的基因型一致，但各基因在遺傳進(jìn)化樹(shù)上的距離較遠(yuǎn)，均進(jìn)化出不同亞分支，而且在受體結(jié)合位點(diǎn)、潛在糖基化位點(diǎn)和其他關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸均有差異，表明H9N2亞型AIV病毒在這10年間基因組變化相對(duì)穩(wěn)定，但在進(jìn)化過(guò)程中哺乳動(dòng)物宿主適應(yīng)性增強(qiáng)、跨種間感染風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，加強(qiáng)對(duì)H9N2 AIV的長(zhǎng)期持續(xù)監(jiān)測(cè)、掌握其遺傳進(jìn)化規(guī)律，不僅可為防控該亞型禽流感病毒的疫苗研制提供理論依據(jù)，而且對(duì)保障公共衛(wèi)生安全具有重要意義。