超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鵝可食用組織中維吉尼亞霉素M1的殘留量

高 蕊，王霄旸，李繼東，薛飛群，張可煜，王春梅，周 文

（1.寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

維吉尼亞霉素（virginiamycin, VGM）又名純霉素、維及霉素、威里霉素、抗金葡霉素等，是由維吉尼亞鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的鏈陽性菌素。這類抗生素中的每一個成員至少由兩種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的分子組成，維吉尼亞霉素則主要由M1與S1兩種抗菌因子構(gòu)成，M1因子為大環(huán)內(nèi)酯，S1因子為環(huán)狀多肽。結(jié)構(gòu)式見圖1。當M1與S1因子的比例構(gòu)成達到7∶3時，其抗菌活性最強。維吉尼亞霉素通過阻止細菌蛋白質(zhì)的合成而達到殺菌作用[1]，主要對八疊球菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有抑制作用，可用于治療肝膿腫[2]、雞壞死性腸炎[3]等疾病。同時該藥具有明顯的促生長作用，能提高飼料的利用率[4-5]，也因此作為飼料添加劑在畜禽中廣泛使用。

圖1 維吉尼亞霉素M1（A）和維吉尼亞霉素S1（B）Fig.1 Virginiamycin M1 (A) and Virginiamycin S1 (B)

經(jīng)過研究表明，維吉尼亞霉素的使用會降低某些藥物的藥效，例如普那霉素（Pristinamycin）[6]。一些學者研究發(fā)現(xiàn)維吉尼亞霉素的持續(xù)使用可能會通過糞便傳播、機體殘留蓄積等方式增加人類對鏈球菌耐藥的屎腸球菌感染的可能性[7-8]，維吉尼霉素發(fā)揮作用的主要是M1組分，且在機體內(nèi)代謝比較緩慢。因此檢測維吉尼亞霉素殘留時常將維吉尼亞霉素M1組分作為殘留標識物。加拿大作為維吉尼亞霉素預混劑的原研國，已經(jīng)將維吉尼亞霉素殘留標識物修訂為M1，并在“食品中獸藥最大殘留限量（maximum residue limit, MRL）清單中規(guī)定，雞和豬的肝臟、皮脂、肌肉、腎臟的MRL分別為300 μg/kg、400 μg/kg、100 μg/kg和400 μg/kg”。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年發(fā)布的GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》，也將殘留標示物修訂為M1，其中規(guī)定了家禽和豬的肌肉、皮脂、肝、腎的MRL分別為100 μg/kg、400 μg/kg、300 μg/kg和400 μg/kg，出于交叉耐藥性的考慮，歐盟于1999年起禁止維吉尼亞霉素作為動物的飼料添加劑使用，而從2006年1月起，更是全面禁止食品動物使用抗生素作為促生長飼料添加劑。我國也自2021年7月1日起規(guī)定，包括維吉尼亞霉素預混劑在內(nèi)的12種促生長藥物飼料添加劑（AGPs）被禁止生產(chǎn)、進口、經(jīng)營和使用。

此前已經(jīng)建立了檢測豬、雞可食性組織中維吉尼亞霉素M1殘留的檢測方法[9]，很少有人去關(guān)注鵝可食性組織中維吉尼亞霉素M1的殘留情況。俄羅斯、中亞各國、中東伊斯蘭教國家都喜食鵝肉，國際上對鵝肉、鵝肝等需求量呈明顯的增長趨勢。鵝作為常見家禽在我國養(yǎng)殖中也占了很大的比重。因此，建立一種快捷、高效的檢測鵝可食性組織中維吉尼亞霉素M1殘留量的方法是必要的，不僅提高了檢測效率，也為建立標準檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC system、電噴霧質(zhì)譜儀Waters TQ-S購自美國Waters公司；分析天平XS105DR購自梅特勒托利多公司；精密天平XS4002S購自梅特勒托利多公司；超聲波清洗儀KQ-500DE購自上海超聲波儀器廠；離心機LXJ-IIB購自上海安亭科學儀器廠；渦旋混合器Genie-2購自Scientific Industries公司；高速勻漿機購自Waring公司。

1.2 材料試劑 空白鵝購自杭州蕭山漢潮家禽有限公司；維吉尼亞霉素M1對照品，CAS Number：21411-53-0，購自Sigma公司，美國，純度：含量≥93%。乙腈為色譜純，購自塞默飛世爾公司；甲酸為色譜純，購自Sigma公司；正己烷為分析純，購自國藥試劑化學品有限公司。

1.3 標準溶液的配制 準確稱取維吉尼亞霉素M1對照品5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用適量乙腈使其溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為50 μg/mL的維吉尼亞霉素M1標準貯備液。維吉尼亞霉素M1標準中間液：準確量取維吉尼亞霉素M1標準貯備液，并用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度為0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和9 μg/mL的維吉尼亞霉素M1標準中間液。標準工作液：使用前將維吉尼亞霉素M1標準中間液用乙腈-水（60∶40）混合液稀釋成濃度為2、10、20、40和60 ng/mL的維吉尼亞霉素M1系列標準工作液，供液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀測定。

1.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用Infusion方式對維吉尼亞霉素M1直接進行質(zhì)譜方法摸索，掃描范圍設(shè)定為m/z 80～600，結(jié)果可見M1的分子離子峰[M+H]+526.3。在正離子掃描模式下，進行多反應監(jiān)測方法篩選子離子，得到355.1和337.1兩個響應較高的子離子，優(yōu)化碰撞能（collision energe，CE），質(zhì)譜條件為：離子源溫度為150℃，脫溶劑溫度為200℃，毛細管電壓為3.0 kV，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔反吹氣流速為150 L/h，定性、定量離子對、碰撞能量和錐孔電壓，見表1。維吉尼亞霉素M1的全掃描質(zhì)譜圖，見圖2，維吉尼亞霉素M1子離子掃描圖，見圖3。

表1 維吉尼亞霉素M1的定性、定量離子對、碰撞能量和錐孔電壓Table 1 The qualitative and quantitative ion pair of VGM-M1 and the collision energy and cone voltage

圖2 維吉尼亞霉素M1全掃描圖（碰撞能量：4eV）Fig.2 Full scan of VGM-M1 (collision energy: 4eV)

圖3 維吉尼亞霉素M1子離子掃描圖（碰撞能量：18eV）Fig.3 Scanning image of VGM-M1 daughter ion (collision energy: 18eV)

1.5 液相條件的優(yōu)化 采用了Waters Atlantis UPLC BEH C18 液相色譜柱（1.7 μm，2.1×100 mm），流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水，柱溫：30℃；進樣量：5 μL；流速：0.2 mL/min；經(jīng)過液相條件的優(yōu)化，最終采用梯度洗脫的方式。梯度洗脫程序為：初始30%A；0～1 min，A由線性升至30%；3～6 min，A線性升至42%；6.5～8.5 min，A線性升至95%；9～10 min，A線性降為30%。保留時間為5.27 min。

1.6 樣品前處理過程的優(yōu)化 稱取均質(zhì)組織2.00 g（±0.02 g），置于50 mL離心管中，其中肌肉組織加入2 mL水，渦旋2 min，加入4 mL乙腈；其他組織直接加入4 mL乙腈，各組織加入乙腈后渦旋2 min，超聲30 min, 4000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL具蓋離心管中。再次向殘渣中加入2 mL乙腈，重復提取一次，合并上清液，備用。在合并的提取液中，加水至約9.5 mL，渦旋混合30 s，加入3 mL正己烷除脂，渦旋30 s，4000×g離心10 min，棄去上層正己烷層，重復除脂一次，盡量完全棄去上層正己烷后，轉(zhuǎn)移至10 mL刻度試管中，加水至10 mL，渦旋混合30 s，備用。

肌肉試料經(jīng)上述過程處理后，提取液0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，供液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀測定。肝臟試料處理后準確量取2.0 mL提取液溶液加入4.0 mL乙腈-水（60∶40）混合液，渦旋30 s混合后，0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，供液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀測定。腎臟和皮脂試料處理后分別準確量取2.0 mL提取溶液加入6.0 mL乙腈-水（60∶40）混合液，渦旋30 s后，0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，供液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀測定。

1.7 方法學研究

1.7.1 標準溶液穩(wěn)定性研究 取新鮮配制的維吉尼亞霉素M1貯備液，稀釋成0.02、0.06和0.08 μg/mL的標準工作液，分別存貯在-20℃、4℃、室溫避光及20℃光照條件下，同一條件下每個水平有兩個平行樣，計算3個濃度的含量百分比。

1.7.2 基質(zhì)效應研究 按1.3配制系列維吉尼亞霉素M1標準工作液，濃度為2、10、20、40和60 ng/mL，進樣測定后繪制標準曲線A。取各個組織的空白試樣，按照1.6方法處理空白樣品，在定容前加入相應濃度的維吉尼亞霉素M1標準中間液，再定容或稀釋，0.22 μm濾膜過濾，進樣測定后，繪制各個組織維吉尼亞霉素M1系列濃度的基質(zhì)添加標準曲線B；通過計算標準曲線B與標準曲線A的斜率比值判斷是否有基質(zhì)效應。

1.7.3 特異性 按照1.6樣品前處理方法對空白試樣和空白添加試樣提取制備后，按照1.4和1.5的液相、質(zhì)譜方法進行進樣測定，觀察是否有空白組織是否對維吉尼亞霉素M1存在干擾。

1.7.4 線性 按照1.3的方法配制成維吉尼亞霉素M1濃度為2、10、20、40和60 ng/mL系列標準工作液，鵝的肌肉的基質(zhì)添加標準工作曲線，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以待測物的定量特征離子質(zhì)量色譜峰面積值為縱坐標，待測物標準溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程。

1.7.5 靈敏度 空白添加試樣按照1.6處理后，按照1.4和1.5中的液相、質(zhì)譜條件進行檢測，以待測物的信噪比S/N≥3為方法的檢測限，信噪比S/N≥10為方法的定量限為原則，確定組織中維吉尼亞霉素M1的檢測限和定量限。

1.7.6 精密度和準確度 采用標準添加法，在空白試料中添加定量限濃度、MRL的0.5倍MRL、1倍MRL、2倍MRL的4個水平添加濃度來進行精密度和回收率的考察。每個濃度5個平行樣品，3個批次。以測定濃度與添加濃度的百分比計算試樣的百分回收率；以批內(nèi)5個樣品百分回收率之間的RSD%計算批內(nèi)精密度；以3個批次15個樣品百分回收率之間的RSD%計算批間精密度。

2 結(jié)果

2.1 標準溶液穩(wěn)定性研究 標準溶液穩(wěn)定性測定結(jié)果見表2，結(jié)果表明，標準溶液在4℃條件、室溫避光條件下放置30 d后含量在94.46%-107.90%，穩(wěn)定性較高，在-20℃、室溫光照條件下，10 d以后測定值波動較大，為保證檢測的準確，因此將標準溶液保存時間為4℃避光保存7 d。

表2 標準溶液穩(wěn)定性結(jié)果（n=2）Table 2 Stability results of standard solution (n=2)

2.2 基質(zhì)效應研究 一般規(guī)定，斜率比值在85%～115%時認為不存在基質(zhì)效應。結(jié)果顯示，鵝的肌肉組織標準曲線B與標準曲線A的斜率比值為171.5%，存在基質(zhì)增強效應，其他組織的斜率比值均在85%～115%范圍內(nèi)，因此在測定樣品時鵝的肌肉組織采用基質(zhì)添加工作曲線，其他組織采用標準工作曲線，見表3。

表3 鵝可食性組織中維吉尼亞M1基質(zhì)效應Table 3 Matrix effect of VGM-M1 in edible tissue of geese

2.3 特異性 空白試樣和空白添加試樣的色譜圖，見圖4。結(jié)果顯示，鵝可食性組織基質(zhì)對維吉尼亞霉素M1的檢測無干擾，峰型良好，出峰時間適宜。

圖4 鵝可食性組織中維吉尼亞霉素M1的色譜圖Fig.4 Chromatogram of VGM-M1 in edible tissue of geese

2.4 線性 以待測物的定量特征離子質(zhì)量色譜峰面積值為縱坐標，待測物標準溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性方程，R2均大于0.99，維吉尼亞霉素M1在2.011～60.68 ng/mL檢測濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系（權(quán)重系數(shù)為1/x）。

2.5 靈敏度 以待測物的信噪比S/N≥3為方法的檢測限，信噪比S/N≥10為方法的定量限為原則，測得鵝可食性組織中維吉尼亞霉素M1的檢測限和定量限如表4所示。此方法的靈敏度可滿足維吉尼亞霉素M1的檢測技術(shù)指標要求。

表4 維吉尼亞霉素M1的檢測限和定量限Table 4 Limit of detection and limit of quantification of VGM-M1

2.6 精密度和準確度 根據(jù)NY/T 1896-2010“獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范”中針對準確度和精密度試驗的規(guī)定將定量限、0.5MRL、MRL、2MRL設(shè)定為添加濃度。GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》中維吉尼亞霉素M1的最大殘留限量值見表5。由表6可知，在各個濃度下，本方法的回收率、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均符合獸藥殘留規(guī)范的相關(guān)要求，具有較好的回收率和精密度。

表5 維吉尼亞霉素M1在各個組織中MRLs值Table 5 The MRLs value of VGM-M1 in various tissues

表6 維吉尼亞霉素M1在鵝各組織中的添加回收率Table 6 The spiked recoveries of VGM-M1 in goose organizations

3 討論

目前采用的組織中維吉尼亞霉素殘留檢測方法有 微生物法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。微生物法和酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果受很多因素的影響，導致檢測結(jié)果出現(xiàn)重復性差、準確度不高、檢測線較高等缺點，難以實現(xiàn)標準化，檢測結(jié)果也需要進行確證試驗排除假陽性結(jié)果，存在很多局限性[10]。高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有較高的準確度、靈敏度、更快的分析速度越來越多的應用于殘留檢測[11]。本試驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，分辨率和靈敏度高，基體干擾少，檢測樣本數(shù)量大，分離速度更快，縮短了分析時間。

不同的樣品前處理技術(shù)對樣品檢測也有影響，快速、有效的提取方法不僅提高檢測速度，也提高了檢測效率。Boison等[12]建立了運用LC-MS測定豬的肝臟、腎臟和肌肉組織中維吉尼亞霉素M1殘留量。組織樣品用10 mL甲醇-乙腈（1∶1）勻漿，經(jīng)兩次提取后離心，取其上清液，加入15 mL 0.01 mol/L磷酸銨溶液，用C18固相萃取柱凈化，用水-甲醇（45∶55）洗脫到10 mL氯仿中，去除水層，吹氮氣將氯仿蒸發(fā)。用甲醇和甲酸氨緩沖液溶解并定容，通過0.22 mol/L圓盤過濾器過濾，進行LC-MS分析，定量限為2 mg/kg。該試驗處理樣品過程中應用到有毒溶劑氯仿，而且定量限較高，并不適合推廣。杜業(yè)剛等[13]運用UPLC-MS/MS法同時測定動物源性食品（雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、豬肝、豬腎、雞肝、雞腎、魚）中8種多肽類抗生素，樣品經(jīng)甲醇-水-甲酸（40∶60∶0.1）、1 mol/L硫酸溶液提取，正己烷進行脫脂，HLB固相萃取柱凈化，甲醇-水-甲酸（70∶30∶0.1）洗脫，乙腈-水-甲酸溶液（10∶90∶0.1）溶解定容，過濾后，進行測定。以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液為流動相，選擇反應監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM），外標法定量。結(jié)果表明，維吉尼霉素M1檢出限為0.5 μg/kg，維吉尼霉素S1檢出限為0.1 μg/kg，定量限均為1 μg/kg?；厥章蕿?1.0%～78.2%。這種方法在樣品處理方面選用的試劑較多，可能是導致回收率不高的原因之一。

本試驗中對提取劑進行了篩選，選出了提取效率高的提取劑。根據(jù)維吉尼亞霉素的理化性質(zhì)，查閱相關(guān)文獻和標準后，分別考察了采用乙腈、甲醇、乙酸乙酯及甲醇乙腈按1∶1混合溶液對樣品進行提取的回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈的提取效率最高，一次提取回收率就能達到70%以上，兩次提取后，回收率均能達到90%以上，所以在后續(xù)試驗操作中選擇乙腈作為提取劑。由于組織樣品中脂肪含量較高，為避免影響后續(xù)實驗操作需對樣品進行除脂，本試驗中采用正己烷作為除脂劑，將除脂后的正己烷層進行吹干再用流動相溶解后，進行檢測，未發(fā)現(xiàn)有M1，表明使用正己烷除脂不會干擾M1的檢測，不影響M1的提取效率。超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用靈敏度較高，在測定標準溶液時，最低檢測限可以達到進樣量10.0 pg，而維吉尼亞霉素在各個組織中的最高殘留限量在100～400 μg/kg，遠遠高于儀器的檢測限，因此在建立方法時，考慮到樣品前處理方法的簡便快速，取消了樣品濃縮步驟，減少了前處理時間，也降低了吹干溶劑時對樣品穩(wěn)定性的影響。標準溶液的配制溶劑對液相峰型有較大影響，在對維吉尼亞霉素M1液相分離條件進行探索時發(fā)現(xiàn)，只有在乙腈-水比例接近6∶4時才能得到較好的峰型，因此在乙腈提取液中加入超純水，調(diào)節(jié)進樣液中溶劑比例。在前處理時，由于肌肉組織質(zhì)地較硬，加入乙腈渦旋處理時，易結(jié)塊，影響提取效率，故在取樣后，先加入2 mL水，進行渦旋，再用乙腈進行提取，則不會出現(xiàn)明顯的結(jié)塊現(xiàn)象。由于每個組織的MRLs值不一樣，而考慮到檢測時標準曲線的線性范圍要適合于所有組織的測定，并且滿足于定量限回收率的檢測要求，因此將腎臟、肝臟和皮脂組織在定容后按比例稀釋，使其實際檢測溶液濃度范圍與肌肉組織一致。

本研究采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測鵝可食性組織中維吉尼亞霉素M1的殘留量，經(jīng)過樣品前處理過程的優(yōu)化后，簡化了提取過程，提高了提取效率。最終得到鵝各組織的定量限分別為：肌肉10.0 μg/kg、肝臟50.0 μg/kg、腎臟50.0 μg/kg、皮脂50.0 μg/kg，檢測限均小于10 μg/kg。本研究建立的檢測方法靈敏度高、準確度好、樣品處理過程簡便快速，通過靈敏度、線性、回收率、精密度等方法學驗證后，各項指標均滿足標準要求，因此本方法完全可滿足我國市場對鵝可食性組織中維吉尼亞霉素M1殘留量的檢測要求。