2017-2020年我國部分地區(qū)PRRSV流行毒株變異情況分析

吳 瑕，勞夢琴，譚祥梅，陳鵬飛，于家榮，朱鈞銳，張玉嬌，虞凌雪，高 飛，姜一峰，童光志，周艷君

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀及死亡的高度接觸性傳染病，其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種易于發(fā)生變異和重組的單股正鏈RNA病毒，該疾病可造成持續(xù)性感染和免疫抑制，對養(yǎng)豬業(yè)危害極為嚴重[1]。上世紀80年代PRRS在美國首次被報道，當時因病原體未知被稱為“豬神秘病”[2]，我國于1996年首次分離到PRRSV并命名為CH-1a[3]，2006年此后流行的PRRSV基因組發(fā)生變異，在Nsp2基因處出現(xiàn)30個氨基酸不連續(xù)缺失，稱之為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV），該毒株可感染各個年齡階段的豬只，發(fā)病率可達50%～100%，死亡率達20%～100%，感染豬群主要表現(xiàn)出高熱、高發(fā)病率和高死亡率的典型特征，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成極大經(jīng)濟損失[4-5]。2014年，我國報道了基因組出現(xiàn)明顯變異和易重組的NADC30樣PRRSV[6-8]。近年來，PRRSV重組毒株的增加和重組頻率的提高，使得PRRSV在我國的流行情況變得更為復雜，表明PRRSV基因重組在病毒進化中發(fā)揮了重要作用[9]，而PRRSV的不斷變異和重組也給目前PRRS的控制帶來了不利影響，由此可見，及時監(jiān)測PRRSV的變異情況是疫情有效防控的重要保障。本研究對2017-2020年采集自上海市、浙江省、江蘇省等不同發(fā)病豬場的血清和組織樣品進行PRRSV檢測，并對流行毒株的Nsp2和ORF5等基因進行遺傳進化和序列比較分析，分析PRRSV在我國部分地區(qū)的流行趨勢和變異情況，為指導臨床上對PRRS疫情的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源 發(fā)病豬臨床樣品566份，為2017-2020年采集自上海市、浙江省、江蘇省、江西省、河北省、湖北省、新疆維吾爾自治區(qū)等7個省區(qū)內(nèi)出現(xiàn)流產(chǎn)、咳喘、發(fā)熱和死亡的養(yǎng)豬場中發(fā)病豬的血液和肺臟、淋巴結(jié)、脾臟等組織臟器。

1.2 主要試劑 E.Z.N.A Toatal RNA Kit和Gel Extraction kit購自Omega公司；反轉(zhuǎn)錄酶、2× LATaqPremix、DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker、瓊脂糖、pMD18-T載體購自TaKaRa公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自ThermoFisher公司。

1.3 樣品處理與RNA提取 取組織樣品約0.5 g于2 mL離心管中剪碎，加入1 mL的無菌PBS后用組織高通量研磨儀將其充分碾磨，組織研磨液經(jīng)4℃，10 000 ×g離心10 min，取上清液保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ∵m量上清液用于RNA提取，所有樣品RNA的提取均根據(jù)E.Z.N.A Toatal RNA Kit的說明書操作。將獲得的RNA按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的說明進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 引物設計及RT-PCR擴增 根據(jù)CH-1a（GenBank登錄號：AY032626）、HuN4（GenBank登錄號：EF635006）以及NADC30（GenBank登錄號：JN654459）基因組中Nsp2基因序列，設計檢測引物（表1），其中用Nsp2引物擴增片段大小可以區(qū)分經(jīng)典類毒株（1021 bp）、HP-PRRSV類毒株（931 bp）和NADC30類毒株（628 bp）。PCR擴增反應體系（20 μL）為：2× LATaqPremix 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 pmol/L），cDNA樣品1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應條件為：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，同時，選擇PCR呈陽性的樣品進行DNA膠回收，將目的片段克隆至pMD18-T載體后進行基因測序。

表1 PRRSV檢測及基因擴增引物Table 1 Detection and gene amplification primers of PRRSV

1.5 基因序列分析 應用DNAStar軟件的Clustal W方法對測序得到的PRRSV基因序列與參考毒株（表2）進行核苷酸和氨基酸序列比對分析。應用MEGA7.0對Nsp2和ORF5基因進行進化樹分析。

表2 本研究使用的參考毒株信息Table 2 Reference strain information used in this study

2 結(jié)果

2.1 PRRSV的檢測結(jié)果 以采集樣品cDNA為模板進行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示：所檢樣品中PRRSV陽性樣品共有246份，部分樣品Nsp2基因擴增產(chǎn)物與NADC30樣毒株大小一致（圖1），但各地豬場陽性率差異較大，最低為3.92%，最高達71.60%（表3）。

圖1 PRRSV ORF7和Nsp2基因PCR檢測結(jié)果Fig.1 Identification of PRRSV ORF7 and Nsp2 gene by PCR

表3 PRRSV樣品統(tǒng)計Table 3 The sample statistics of PRRSV

2.2 Nsp2基因進化樹分析 從陽性樣品中選擇31份樣品進行Nsp2基因克隆和測序，與GenBank的代表性參考株序列進行比較分析，并繪制系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，Nsp2基因進化樹將國內(nèi)的美洲型PRRSV基因分成4個譜系：NADC30-like（譜系1）、QYYZ-like（譜系3）、VR-2332-like（譜系5）和HuN4-like/CH-1a-like（譜系8）；本研究獲得的31株PRRSV Nsp2基因主要分布在3個譜系中，即Lineage 8（屬于HP-PRRSV類毒株）、Lineage 5（屬于VR2332類毒株）、Lineage 1（屬于NADC30類毒株），由此表明本研究采集樣品的發(fā)病豬場中主要是以HP-PRRSV類毒株流行為主，NADC30類毒株感染并存（圖2）。31株Nsp2基因測序結(jié)果顯示，各毒株基因長度為1924～2232 bp。與美洲型的代表性參考株VR2332、CH-1a、BJ-4、HuN4、JXA1和NADC30等進行同源性分析。結(jié)果顯示：31株Nsp2基因之間的核苷酸同源性為57.2%～100%，氨基酸同源性為49.6%～100.0%；與VR2332、CH-1a、BJ-4經(jīng)典株的核苷酸同源性為57.9%～97.9%，氨基酸同源性為49.1%～96.4%；與HuN4、JXA1等HPPRRSV株的核苷酸同源性為58.8%～99.7%，氨基酸同源性為51.4%～99.2%；與NADC30株的核苷酸同源性為58.8%～92.4%，氨基酸同源性為53.2%～88.1%。以上結(jié)果表明，PRRSV在自然流行過程中發(fā)生了不同程度的變異。

圖2 PRRSV陽性樣品Nsp2基因的進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of Nsp2 gene in PRRSV positive samples

2.3 Nsp2氨基酸序列分析 在PRRSV編碼的各種蛋白中，Nsp2基因變異最大，常被作為病毒進化和流行病學分析的靶基因，本研究獲得的31個分離株的Nsp2基因編碼氨基酸長度為635～771 aa。其中位于譜系8的23個分離株在481 aa和533～561 aa位置具有不連續(xù)缺失30個氨基酸（1+29 aa），與HP-PRRSV類毒株一致。值得注意的是，其中ZJ11/2017在769～782 aa位置又缺失了14個氨基酸（1+29+14 aa）。位于譜系5的2個分離株與VR2332類似，沒有氨基酸發(fā)生缺失和插入。位于譜系1的6個分離株在320～431 aa、481 aa和533～552 aa位置均有不連續(xù)缺失131氨基酸（111+1+19 aa），保持與NADC30類毒株一致的特征，但其中HBap4/2018與VR2332相比在464～468位又缺失了5個氨基酸（111+5+1+19 aa）（圖3）。

圖3 PRRSV Nsp2氨基酸序列比對Fig.3 PRRSV Nsp2 amino acid sequence alignment

2.4 ORF5遺傳進化及同源性分析 為了分析PRRSV ORF5基因與其他參考毒株的親緣關系，應用MEGA7.0軟件繪制了ORF5基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4）。結(jié)果顯示：本研究獲得的21株ORF5基因序列被分布于3個譜系，其中15株屬于譜系8（HPPRRSV類毒株），5株屬于譜系1（NADC30類毒株），1株屬于譜系3（QYYZ類毒株）。對獲得的21株ORF5基因與參考株進行核苷酸和氨基酸同源性分析。結(jié)果顯示：21株ORF5基因之間的核苷酸同源性為82.6%～99.5%；與VR2332、CH-1a經(jīng)典株的核苷酸同源性為84.4%～100%，氨基酸同源性為83.1%～100%；與JXA1、HuN4等HP-PRRSV株的核苷酸同源性為84.6%～99.5%，氨基酸同源性為83.7 %～99.5%；與NADC30、FJM4等NADC30類的核苷酸同源性為83.7%～94.0%，氨基酸同源性為84.1%～95.0%。

圖4 PRRSV陽性樣品ORF5基因的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of ORF5 gene in PRRSV positive samples

2.5 GP5氨基酸序列比對 對21株ORF5基因進行測序，結(jié)果顯示：ORF5基因為603 bp，編碼200個氨基酸，沒有氨基酸的插入和缺失。氨基酸比對結(jié)果顯示：突變主要位于信號肽和兩個高變區(qū)，在40～57 aa、67～90 aa、107～120 aa和138～160 aa的區(qū)域相對保守。在信號肽區(qū)的F23/S23突變和B細胞表位中的Q196/R196突變主要存在于Lineage8分離株；而在Lineage1分離株中，其信號肽區(qū)（1～31 aa）有8個氨基酸突變，2個高變區(qū)（HVR）中有4個氨基酸突變，3個跨膜區(qū)中有7個氨基酸突變，與跨膜區(qū)重疊的T細胞表位有3個氨基酸突變，另外2個抗原表位中有5個氨基酸突變，其他區(qū)域有5個氨基酸突變，提示Lineage1分離株突變程度高。位于GP5HVR1的第32、33、34、35位N-糖基化位點也存在不同程度的突變，N-糖基化位點對病毒感染、抗原特性以及病毒對體外中和抗體的敏感性都很重要。有研究報道R13和R151與毒力有關，本研究獲得的Lineage1分離株都存在R13/Q13和R151/K151的突變（除SHtl2/2019的R151沒有突變而外），在Lineage8中有4株存在R151/K151的突變（圖5）。

圖5 GP5蛋白氨基酸序列分析Fig.5 Amino acid sequence analysis of GP5 protein

2.6 Nsp9氨基酸序列比對分析 Nsp9蛋白具有RNA依賴性聚合酶活性（RdRp），參與PRRSV的亞基因組mRNA轉(zhuǎn)錄和基因組復制，為了分析PRRSV Nsp9的變異情況，將12株Nsp9基因進行序列比對分析。結(jié)果顯示：12株Nsp9基因與參考株的核苷酸同源性為85.2%～99.6%，氨基酸同源性為94.2%～99.7%。先前的研究表明Nsp9的519、544、550位是與HP-PRRSV毒力變化相關的氨基酸，本研究獲得了12株Nsp9，除了1株的544位氨基酸與經(jīng)典株一致而外，其余毒株均保持了與HP-PRRSV類毒株一致的氨基酸特征（圖6）。

圖6 Nsp9與毒力相關的氨基酸比較Fig.6 Comparison of amino acids related to virulence of Nsp9

3 討論

由于PRRSV基因組易于變異，可導致PRRSV發(fā)生免疫逃逸，因此PRRS成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一[10]。盡管在當前為了防控非洲豬瘟疫情而采取了嚴格的生物安全措施的情況下，一些養(yǎng)豬場依然存在PRRSV感染，對生豬生產(chǎn)造成不利的影響。目前在我國先后流行的有經(jīng)典的CH-1a類毒株、HP-PRRSV類毒株以及NADC30類毒株等具有不同致病力的毒株[11-12]，因此有必要及時監(jiān)測PRRSV的基因組變異情況。本研究檢測并分析了2017-2020年從上海市、浙江省、江蘇省等7個省市的部分發(fā)病豬場采集的臨床樣品，發(fā)現(xiàn)樣品中PRRSV陽性率仍然較高。Nsp2是PRRSV中變異最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，對病毒復制、轉(zhuǎn)錄、病毒毒力以及調(diào)節(jié)宿主免疫應答具有重要作用。Nsp2基因中存在缺失、重組、插入等多種突變方式，使得Nsp2基因片段的大小存在很大差異[13]。因此，Nsp2常作為分析PRRSV遺傳變異與進化分析的目的基因，本研究對31株Nsp2基因編碼的氨基酸序列進行比對分析，證明PRRSV陽性樣品中除了具有HP-PRRSV類毒株和NADC30類毒株的常見氨基酸缺失模式外，還出現(xiàn)了“111+5+1+19 aa”、“1+29+14 aa”的缺失模式，這種缺失模式是否對其致病性產(chǎn)生影響尚不清楚。其中23株流行株保留了HP-PRRSV類毒株的缺失特征，6株具有NADC30類毒株的缺失特征，只有2株與VR2332類毒株一樣，沒有氨基酸缺失或插入。PRRSV流行株的遺傳變異分析結(jié)果表明，本研究獲得的PRRSV主要分布在譜系L8、L1、L5，其中大部分為L8，其次是L1，表明在2017-2020年采集樣品的豬場中流行的PRRSV主要是以HP-PRRSV類毒株為主，其次是NADC30類毒株。

PRRSV ORF5基因也是常用于分析病毒遺傳變異的靶基因，其編碼的GP5蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白中變異最大的蛋白，GP5蛋白存在多個N-糖基化位點和中和性抗原表位，在病毒的復制、毒力以及誘導宿主的中和抗體產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[14-15]。在本研究我們對獲得的21株ORF5基因進行序列分析，發(fā)現(xiàn)有14株與HP-PRRSV類毒株同屬一個亞群（L8），5株與NADC30類毒株同屬于一個亞群（L1），1株與CH-1a類毒株同屬于一個亞群，1株與QYYZ毒株同屬于一個于亞群（L3）。表明除了HP-PRRSV流行毒株外，NADC30類毒株的流行逐漸增多。此外，本研究發(fā)現(xiàn)有14株在中和表位37～44 aa處發(fā)生L39/I39的氨基酸突變，有1株存在H38/L39/Y38S39的氨基酸突變，而中和表位的突變可能有助于病毒逃避疫苗免疫誘導的中和作用，進而降低疫苗免疫保護效率。有研究報道GP5中的R13和R151氨基酸與毒力有關[16]，Nsp9的519、544、550位氨基酸殘基是HP-PRRSV毒力的關鍵氨基酸[17]，本研究獲得的毒株中，有5株病毒在GP5蛋白存在R13/Q13的突變，8株存在R151/K151的氨基酸突變；而12株Nsp9中，除了1株在544位氨基酸與經(jīng)典毒株相同而外，而其他毒株毒力相關氨基酸均與HP-PRRSV類毒株一致，這些關鍵氨基酸的變異可能會影響PRRSV致病性。此外，發(fā)現(xiàn)同一毒株的ORF5和Nsp2基因分別屬于不同譜系，表明其可能存在潛在的重組事件。由此可見，突變和重組是PRRSV進化的重要策略，只有實時監(jiān)測和掌握PRRSV的變異情況及流行動態(tài)，才能有效預防PRRSV疫情的發(fā)生。