慢病毒載體法制備紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠

賈俊雙，肖高芳，林曉琳，張 晟，姚志芳，杜文婷，申紅芬，劉 科，饒子亮，孫 妍，姚開泰，肖 東，

（南方醫(yī)科大學(xué)1.腫瘤研究所，2.比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515；3.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 528248）

轉(zhuǎn)基因小鼠已成為研究基因功能、開展發(fā)育生物學(xué)研究、建造人類疾病動(dòng)物模型及研究人類疾病發(fā)病機(jī)制等的最重要的和最佳的模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［1］。原核顯微注射法為目前最經(jīng)典的和最成熟制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，但其制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率很低。近年來，隨著不同用途慢病毒載體的問世，慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法逐漸受到人們青睞；與原核顯微注射法相比，慢病毒載體法主要優(yōu)勢(shì)如下：（1）操作較原核顯微注射法簡(jiǎn)單的多，容易被一般人掌握；（2）對(duì)用于制作轉(zhuǎn)基因小鼠的小鼠品系無特殊要求，原核顯微注射時(shí)注射針必須插入核膜清晰的核內(nèi)，因不同品系小鼠原核大小和核膜清晰度差異明顯，而慢病毒受精卵卵周隙注射時(shí)，注射針無需插入核內(nèi)；（3）高的胚胎存活率，因慢病毒卵周隙注射時(shí)對(duì)細(xì)胞膜和核膜均無損傷；（4）慢病毒載體法的轉(zhuǎn)基因效率遠(yuǎn)高于原核顯微注射法［2，3］。

利用遺傳工程小鼠在體內(nèi)解析基因功能的策略可分為：基因功能缺失（Loss of gene function）和基因功能獲得（gain of gene function）；在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因功能缺失的策略主要包括：（條件性）基因敲除、（條件性）轉(zhuǎn)基因RNA干涉（RNAi）和負(fù)顯性突變體（dominant negative mutant）技術(shù)等，而在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因功能獲得的主要策略：目的基因（條件性）過表達(dá)等；近若干年來，針對(duì)不同基因采用不同的基因功能研究策略，利用不同類型的慢病毒載體借助慢病毒載體法建立了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因小鼠，在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)已實(shí)現(xiàn)或有望實(shí)現(xiàn)如下目標(biāo)：（1）基因功能獲得［目的基因（條件性）過表達(dá)］和（2）基因功能缺失［（條件性）轉(zhuǎn)基因RNAi和負(fù)顯性突變體技術(shù)］，以上策略和方法許多已成功用于在小鼠體內(nèi)解析基因功能，這些都說明基于慢病毒載體法制備的轉(zhuǎn)基因小鼠為活體內(nèi)研究基因功能提供了理想三維研究體系［2-10］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體和細(xì)胞：慢病毒載體phUb-mRFP［11］由美國(guó)斯坦福大學(xué)的Sanjiv Sam Gambhir博士惠贈(zèng)，phUb-mRFP中含紅色熒光蛋白（monomeric red fluorescence protein，mRFP）基因，其表達(dá)受人泛素啟動(dòng)子（human ubiquitin promoter，hUb promoter）調(diào)控。慢病毒包裝系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen公司。293FT細(xì)胞來源和培養(yǎng)方法等參見文獻(xiàn)［12］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR小鼠（SPF級(jí)，6～8周齡，質(zhì)量16～22g）由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005），飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)，設(shè)施使用合格證號(hào)：SYXK（粵）2006-0074。ICR小鼠用作以下群體：供受精卵用雌鼠、種公鼠、假孕母鼠和結(jié)扎雄鼠。

1.1.3 主要試劑：PCR擴(kuò)增試劑dNTP和Taq酶及限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自大連TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，KSOM培養(yǎng)液和FHM操作液購(gòu)自Chemicon公司，透明質(zhì)酸酶、礦物油和細(xì)胞松弛素購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用試劑等來源參見文獻(xiàn)［12］，其余試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)純或分析純。

1.2 方法

1.2.1 phUb-mRFP酶切鑒定：用NotI、MluI和BamHI對(duì)phUb-mRFP進(jìn)行單酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 慢病毒的包裝、濃縮及鑒定：慢病毒包裝、濃縮和保存步驟和方法詳見文獻(xiàn)［12］和Invitrogen公司操作手冊(cè)。經(jīng)超速離心濃縮的病毒分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?；用濃縮后的病毒感染293FT細(xì)胞，24～48h后熒光顯微鏡下觀察是否見紅色熒光，以確認(rèn)病毒是否成功生產(chǎn)。

1.2.3 慢病毒卵周隙注射制備mRFP轉(zhuǎn)基因小鼠：超數(shù)排卵后采集受精卵，然后將濃縮后的病毒注射入小鼠受精卵的卵周隙中，并將注射后狀態(tài)良好的受精卵移植進(jìn)ICR假孕母鼠輸卵管內(nèi)，仔鼠一般19.5～20.0d后出生。假孕母鼠和結(jié)扎雄鼠制備以及超數(shù)排卵、受精卵采集、病毒卵周隙注射和受精卵移植等方法參見文獻(xiàn)［3，13］。

1.2.4 利用體視熒光顯微鏡篩選與鑒定mRFP轉(zhuǎn)基因首建鼠：將出生幾天后的仔代乳鼠置于體視熒光顯微鏡下，檢測(cè)mRFP表達(dá)以初篩mRFP轉(zhuǎn)基因鼠，并從中選出熒光強(qiáng)度適中的乳鼠，作標(biāo)記。此外，小鼠出生3周后，剪取6只F0代鼠的鼠耳，并置于體視熒光顯微鏡下，檢測(cè)mRFP表達(dá)以進(jìn)一步鑒定mRFP轉(zhuǎn)基因鼠，并從中選出熒光強(qiáng)度適中的mRFP轉(zhuǎn)基因首建鼠。

1.2.5 采用PCR進(jìn)行基因型鑒定以驗(yàn)證體視熒光顯微鏡鑒定結(jié)果：在利用體視熒光顯微鏡初篩和鑒定mRFP轉(zhuǎn)基因鼠的基礎(chǔ)上，應(yīng)用PCR驗(yàn)證mRFP陽性的轉(zhuǎn)基因鼠基因組是否成功整合轉(zhuǎn)基因mRFP。步驟與方法如下：

1.2.5.1 鼠尾基因組DNA提取：小鼠出生3周后，剪鼠尾，采用基因組DNA提取試劑盒（申能博彩生物科技有限公司）從潛在的mRFP轉(zhuǎn)基因鼠和野生型ICR鼠（陰性對(duì)照）鼠尾組織提取基因組DNA，操作參見試劑盒說明書和文獻(xiàn)［14，15］。

1.2.5.2 基因型鑒定PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因用引物：P1，5′-CGATGACTTACTGGCGGGT-3′；P2，5′-CGCACCGTATTGGCAAGCA-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃7min；變性95℃50s，退火54℃50s，延伸72℃1min，30個(gè)循環(huán)；延伸72℃，7min。PCR擴(kuò)增后，取5μL反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 mRFP轉(zhuǎn)基因首建鼠繁殖傳代及轉(zhuǎn)基因遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性檢測(cè)：將mRFP表達(dá)陽性及PCR陽性的首建鼠（R3和R4）與野生型ICR鼠交配以傳代，獲得F1后，用小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)mRFP是否在F1代表達(dá)，對(duì)其表達(dá)穩(wěn)定性作出判斷，并進(jìn)而間接判斷外源轉(zhuǎn)基因是否穩(wěn)定遺傳。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒載體phUb-mRFP鑒定

phUb-mRFP經(jīng)NotI、MluI和BamHI分別單酶切，產(chǎn)物經(jīng)電泳均可見兩條帶，其大小與理論預(yù)測(cè)值相符（圖1）。此外，對(duì)phUb-mRFP載體啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序亦證實(shí)phUb-mRFP載體是正確的（數(shù)據(jù)未顯示）。

泳道1：DL15 000 marker（TaKaRa）；泳道1～3：NotI，MluI或BamHI分別酶切phUb-mRFP圖1 慢病毒載體phUb-mRFP酶切鑒定LaneM1：DL15 000（TaKaRa）；Lane 1～3：phUb-mRFP cut by NotI，MluIorBamHI，respectively.Fig.1 Lentiviral vector of phUb-mRFP identified by enzymatic digestion

2.2 攜帶mRFP基因慢病毒的包裝、濃縮及成功生產(chǎn)鑒定

將phUb-mRFP與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，48h后倒置熒光顯微鏡下可見紅色熒光，預(yù)示轉(zhuǎn)染成功（圖2A）。收集的病毒上清經(jīng)超速離心濃縮后感染293FT細(xì)胞，48h后倒置熒光顯微鏡下可見紅色熒光（圖2B），預(yù)示病毒成功生產(chǎn)；細(xì)胞爬片結(jié)果顯示濃縮后的病毒可高效率感染293FT細(xì)胞（數(shù)據(jù)未顯示）。以上結(jié)果表明mRFP轉(zhuǎn)基因能夠正常表達(dá)（圖2見彩插）。

2.3 mRFP轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

目前，慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因小鼠有兩種方法：慢病毒卵周隙注射法和慢病毒感染去透明帶的受精卵法。本研究采用慢病毒卵周隙注射法建立mRFP轉(zhuǎn)基因小鼠，如圖3所示。

圖3 慢病毒受精卵卵周隙注射示意圖Fig.3 Schematic illustration of subzonal injection（SLI）of lentivirus into a single-cell zygote

本研究先利用體視熒光顯微鏡通過檢測(cè)mRFP表達(dá)以從出生后的小鼠中篩選與鑒定mRFP轉(zhuǎn)基因首建鼠，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用PCR進(jìn)行基因型鑒定以驗(yàn)證體視熒光顯微鏡鑒定結(jié)果。

慢病毒注入48枚單細(xì)胞受精卵的卵周隙后，存活胚胎42枚，將其中40枚胚胎移植給2只假孕母鼠，2只均懷孕［受孕率為100％（2/2）］，共獲仔鼠6只［產(chǎn)仔率為15％（6/40）］。

將出生幾天的子代乳鼠置于體視熒光顯微鏡下，觀察發(fā)現(xiàn)其中兩只強(qiáng)表達(dá)mRFP（圖4）。小鼠出生3周后，利用體視熒光顯微鏡檢測(cè)mRFP表達(dá)，在蛋白水平證實(shí)6只出生的F0代中，2只（R3和R4）鼠耳強(qiáng)表達(dá)mRFP，其余的弱表達(dá)mRFP（R1，R2和R5 R6）或熒光強(qiáng)度（R6）與野生型ICR小鼠無明顯差別（圖5A）。

DNA水平檢測(cè)證實(shí)，6只F0代中，5只（其中包括強(qiáng)表達(dá)mRFP的2只）基因組中整合有外源基因mRFP，即獲得5只PCR陽性的mRFP轉(zhuǎn)基因首建鼠，首建鼠mRFP整合率達(dá)83％（圖5B）?？梢?，采用PCR進(jìn)行基因型鑒定很好驗(yàn)證了體視熒光顯微鏡鑒定結(jié)果。

2.4 mRFP轉(zhuǎn)基因遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性檢測(cè)

為證實(shí)首建鼠所攜帶的外源基因可否穩(wěn)定遺傳，將mRFP表達(dá)陽性及PCR陽性的首建鼠（R3和R4）與野生型ICR鼠交配以獲得F1代。小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)顯示，F(xiàn)1代鼠中部分個(gè)體表達(dá)mRFP（圖6），這預(yù)示外源基因不僅可以從一代向下一代穩(wěn)定傳遞，且能夠穩(wěn)定表達(dá)（圖2、4～6見彩插1）。

3 討論

3.1 探索非損傷可視轉(zhuǎn)基因跟蹤策略與方法

轉(zhuǎn)基因小鼠制作以及隨后的培育、純合子獲得和建系等都是費(fèi)事、費(fèi)時(shí)和費(fèi)力的工作。如何將繁重的工作降下來一直是許多研究者探索的問題，我們也在積極探索簡(jiǎn)便易行的“非損傷可視外源轉(zhuǎn)基因跟蹤”策略與方法，以便替代PCR和Southern Blot等傳統(tǒng)跟蹤轉(zhuǎn)基因的方法。如mRFP轉(zhuǎn)基因小鼠篩選與鑒定過程中，首先應(yīng)用體視熒光顯微鏡檢測(cè)各組織（鼠耳、皮膚和毛發(fā)等）中mRFP表達(dá)情況以初步篩選并鑒定mRFP轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)mRFP表達(dá)水平較高的鼠進(jìn)行基因型鑒定（利用PCR技術(shù)），結(jié)果顯示這些鼠基因組中確實(shí)整合了外源轉(zhuǎn)基因mRFP。至此，我們初步建立了簡(jiǎn)便易行的“非損傷可視外源轉(zhuǎn)基因跟蹤”策略與方法，該方法有望替代PCR和Southern Blot等傳統(tǒng)跟蹤轉(zhuǎn)基因的方法。

3.2 慢病毒感染受精卵方式的選擇

慢病毒感染去透明帶的受精卵法的優(yōu)點(diǎn)：（1）較好控制外源轉(zhuǎn)基因整合拷貝數(shù)；（2）無需特殊儀器和無需熟練的顯微操作技術(shù)；（3）適合慢病毒大批量感染受精卵。慢病毒感染去透明帶的受精卵法的缺點(diǎn)：（1）去透明帶時(shí)間不易控制，時(shí)間稍長(zhǎng)即會(huì)對(duì)胞膜造成損傷；（2）胚胎存活率下降；（3）移植率和妊娠率下降去透明帶法中，胚胎需在體外培養(yǎng)2～3d，在體外過長(zhǎng)時(shí)間操作，致使胚胎發(fā)育延遲，且胚胎在去除透明帶后變得容易相互黏附，移植時(shí)胚胎形成聚合體，導(dǎo)致移植率和妊娠率下降。慢病毒卵周隙注射法的優(yōu)點(diǎn)：（1）胚胎存活率高（因卵周隙注射對(duì)細(xì)胞膜和核膜均無損傷）；（2）移植率和妊娠率高（胚胎有透明帶保護(hù)，同時(shí)慢病毒注射后胚胎當(dāng)日或次日即植入假母體內(nèi)）。慢病毒卵周隙注射法的缺點(diǎn)：（1）外源轉(zhuǎn)基因整合拷貝數(shù)不易控制（因無法精確控制注射入透明帶下慢病毒的量，造成不同首建鼠間外源基因整合拷貝數(shù)不一致）；（2）需要特殊儀器和熟練操作技術(shù)人員?？梢?，慢病毒受精卵卵周隙注射法和慢病毒感染去透明帶的受精卵法各有優(yōu)勢(shì)，但前者最為常用。

本課題曾嘗試用慢病毒感染去透明帶的受精卵來制備轉(zhuǎn)基因小鼠，但由于無法克服該方法固有的缺陷，如去透明帶后的胚胎往往粘附聚團(tuán)，極大延遲胚胎發(fā)育，甚至導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止，從而降低移植率和妊娠率。鑒此，本研究采用透明帶下注射慢病毒法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，以確保得到較高質(zhì)量的胚胎及較高的移植率和妊娠率等。

3.3 影響mRFP轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá)因素的分析

在建立轉(zhuǎn)基因小鼠的過程中，同一轉(zhuǎn)基因在不同首建鼠，外源轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平往往不同，位置效應(yīng)和轉(zhuǎn)基因整合拷貝數(shù)的不一致通常是造成外源轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平有差異的主要原因。本研究數(shù)據(jù)顯示，在得到的5只mRFP轉(zhuǎn)基因小鼠中，3只小鼠弱表達(dá)mRFP或紅色熒光強(qiáng)度與野生型ICR小鼠無明顯差異，2只小鼠（R3和R4）強(qiáng)表達(dá)mRFP，造成如此結(jié)果的可能原因有：（1）外源轉(zhuǎn)基因在染色體上插入位點(diǎn)不同，（2）外源轉(zhuǎn)基因在基因組中整合拷貝數(shù)有差異等。接下來，本研究將從5只mRFP表達(dá)水平較強(qiáng)的mRFP轉(zhuǎn)基因首建鼠中挑選R3和R4進(jìn)行mRFP轉(zhuǎn)基因鼠的培育、建系和保種等。

總之，本研究采用慢病毒受精卵卵周隙注射法成功建立mRFP轉(zhuǎn)基因鼠，得以熟練掌握基于慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的技術(shù)，這為基于慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，以為活體內(nèi)研究基因功能提供了技術(shù)保障。

［1］Sun Y，Chen X，Xiao D.Tetracycline-inducible expression systems：new strategies and practices in the transgenic mouse modeling［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2007，39（4）：235-246.

［2］Lois C，Hong EJ，Pease S，et al.Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors［J］.Science，2002，295（5556）：868-872.

［3］Singer O，Tiscornia G，Ikawa M，et al.Rapid generation of knockdown transgenic mice by silencing lentiviral vectors［J］.Nat Protoc，2006，1（1）：286-292.

［4］Dann CT，Garbers DL.Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes［J］.MethodsMolBiol，2008，450：193-209.

［5］Rubinson DA，Dillon CP，KwiatkowskiAV，et al.A lentivirusbased system to functionally silence genes in primary mammalian cells，stem cells and transgenic mice by RNA interference［J］.Nat Genet，2003，33（3）：401-406.

［6］Shin KJ，Wall EA，Zavzavadjian JR，et al.A single lentiviral vector platform formicroRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression［J］.PNAS，2006，103（37）：13759-13764.

［7］Stegmeier F，Hu G，Rickles RJ，et al.A lentiviral microRNA-based system for single-copy polymerase II-regulated RNA interference in mammalian cells［J］.PNAS，2005，102：13212-13217.

［8］Szulc J，W iznerowiczM，SauvainMO，et al.A versatile tool for conditional gene expression and knockdown［J］.Nat Methods.2006，3（2）：109-116.

［9］Tiscornia G，Tergaonkar V，Galimi F，et al.CRE recombinase-inducible RNA interference mediated by lentiviral vectors［J］.PNAS，2004，101：7347-7351.

［10］Ventura A，Meissner A，Dillon CP，et al.Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes［J］.PNAS，2004，101：10380-10385.

［11］Cao F，Lin S，Xie X，et al.In vivo visualization of embryonic stem cell survival，proliferation，and migration after cardiac delivery［J］.Circulation，2006，113（7）：1005-1014.

［12］賈俊雙，孫妍，肖東，等.慢病毒介導(dǎo)的外源基因體外投遞系統(tǒng)的建立［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8（10）：1028-1029，1037.

［13］Nagy A，Gertsenstei M，Vintersten K，et al.Manipulating the mouse Embryo：A Laboratory Manual［J］.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2004，192-203.

［14］XiaoD，Yue Y，DengXY，et al.Rescue of the albino phenotype by introducing a functional tyrosinaseminigene into Kunming albino mice［J］.World J Gastroenterol，2007，13（2）：244-249.

［15］Xu K，Deng XY，Yue Y，et al.Generation of the regulatory protein rtTA transgenic mice［J］.World J Gastroenterol，2005，8（19）：2885-2891.