干擾素脂質(zhì)體的制備與質(zhì)量控制

曾德貴，曾洪輝

(1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020;2.廣東省藥物研究所，廣東 廣州 510440)

干擾素作為細胞因子常被用來治療多種疾病，但其血漿半衰期極短，且副作用大。干擾素為一種活性蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被各種蛋白酶降解或作為抗原被免疫系統(tǒng)排除，因此常規(guī)的全身或局部給藥方式難以使干擾素在病變部位達到較高濃度，藥物的利用度很低。應(yīng)用脂質(zhì)體包裹干擾素能顯著改善其體內(nèi)的藥代動力學(xué)，提供靶向定位給藥，從而增加干擾素的應(yīng)用范圍[1]，提高藥物穩(wěn)定性，并大幅度降低干擾素的毒副作用。為此，筆者制備了干擾素脂質(zhì)體，并對其處方、工藝制備、粒徑、包封率等進行研究，還建立了質(zhì)控體系，報道如下。

1 儀器與試藥

細胞培養(yǎng)設(shè)備;722型分光光度計(上海第三分析儀器廠);SB3200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)械專機廠);超速離心機(美國Beckman);CK2型倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus);H600-4型電子顯微鏡(日本Nikon);AS3120型超聲波儀(天津奧特賽恩斯儀器公司)。色譜用CM-葡聚糖凝膠、乙二醇單甲醚(試劑級);凍干精制人白細胞干擾素(100萬U/支，哈藥集團生物工程有限公司);BR生物試劑脫氧膽酸鈉(北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠);卵磷脂、膽固醇(Sigma產(chǎn)品);IMDM培養(yǎng)基(Gibco產(chǎn)品);胰酶(Difco產(chǎn)品);L929細胞(天津醫(yī)學(xué)院提供);濾泡性口炎病毒(VSV軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院干擾素組提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方與制備

處方:卵磷脂40 mg，膽固醇20 mg，氯仿4 mL，乙醚4 mL，磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)0.5 mL，干擾素-α 100萬U。

制備:取卵磷脂40 mg、膽固醇20 mg，溶于氯仿4 mL，于40℃水浴中，以100～150 r/min轉(zhuǎn)速蒸發(fā)后，加入乙醚4 mL，并將干擾素-α 100萬U溶于0.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中并與之混合，二者經(jīng)超聲處理后進行乳化，然后于40℃水浴中以100～150 r/min轉(zhuǎn)速減壓，除去有機溶劑即可形成α-干擾素脂質(zhì)體，最后再通過凝膠柱層析方法除去未包入的藥物，得到不含游離的α-干擾素脂質(zhì)體。

2.2 質(zhì)量控制

2.2.1 外觀形態(tài)

在干擾素脂質(zhì)體制備的過程中，利用光學(xué)顯微鏡對粗制脂質(zhì)體進行觀察，脂質(zhì)體呈圓形顆粒狀，大小比較均勻。制備的脂質(zhì)體成品經(jīng)負染色后進行電鏡觀察，其背景為黑色，干擾素脂質(zhì)體為白色圓球顆粒，表面光滑、規(guī)整，分散性良好。

2.2.2 粒徑測定

取當日新制備的脂質(zhì)體干擾素-α，加適量生理鹽水稀釋，滴在載膜銅網(wǎng)上，4 min后用濾紙吸去多余的水分，然后滴入2%磷鎢酸(pH=7.4)，4～5 min后吸去多余的磷鎢酸溶液，晾干，于電子顯微鏡下觀察規(guī)則圓點，用庫爾特粒子分析儀測定粒子大小和分布，經(jīng)檢測，干擾素脂質(zhì)體粒徑為正態(tài)分布，脂質(zhì)體平均粒徑為285.6 nm。

2.2.3 包封率測定

微形柱制備:取5 mL注射器筒1個，底部置入一略小于內(nèi)徑的圓形尼龍網(wǎng)，然后加入適量(5 mL)經(jīng)pH為7.2的磷酸鹽緩沖液浸泡的葡聚糖凝膠G-50，將裝好的注射器筒放入干燥離心管內(nèi)，于4℃ 1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，備用。

游離人干擾素-α分離試驗:取含100萬U游離干擾素-α的液體，加到微型柱頂部，以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，收集濾液過濾除菌，作為A液備用。

干擾素脂質(zhì)體中游離干擾素-α分離試驗:取相當于100萬U干擾素的脂質(zhì)體干擾素-α，緩緩加入微形柱頂部，收集濾液，加適量0.4%脫氧膽酸鈉，溫度4℃，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，取下層液體，過濾除菌，作為B液備用。

測定方法:將A液和B液均配制成1 mL的溶液，并取干擾素-α 100萬U溶于1 mL緩沖液中，對此3種溶液采用“細胞病變抑制法”，攻擊病毒采用濾泡性口炎病毒，劑量為300 TCID50。采用40孔培養(yǎng)板。倍比稀釋待測上清液，每孔加入50 μL，隨后各孔加入L929細胞懸液50 μL(內(nèi)含4×104個L929細胞)。設(shè)細胞對照和病毒對照，3個復(fù)孔。37℃ CO2孵箱中15 min。染畢，用水洗脫殘余染料。每孔加入200 μL，用震蕩器振蕩，使染料完全從細胞內(nèi)脫出。用可測微板的722型分光光度計于540 nm波長處比色。

計算包封率(EE):測得游離干擾素-α效價為997.86 U/mL(n=3)，干擾素-α脂質(zhì)體經(jīng)柱分離的游離干擾素-α效價為0，表明該柱能將干擾素完全吸附。將過柱后脂質(zhì)體干擾素-α處理，測定效價為 633.84 U/mL(n=3)。EE(%)=(C游離-C未被包封)/C游離×100%=633.84/997.86×100%=63.52%。

2.2.4 有機殘留量檢測

按2005年版《中國藥典(二部)》要求，利用氣相色譜法測試干擾素脂質(zhì)體溶液中的二氯甲烷(CH2Cl2)殘留量。按外標法計算含量，其結(jié)果遠低于藥典規(guī)定的0.06%。

2.2.5 微生物檢查

對干擾素-α脂質(zhì)體及A液、B液進行鈷源照射滅菌，劑量為0.39 kGy，照射40 min后，接種血平板經(jīng)24 h，無細菌生長，延至48 h，均無細菌生長。

2.2.6 樣品穩(wěn)定性考察

將制備好的3批樣品分別放置在37℃，25℃，2～8℃不同溫度下，分別對其粒徑、滲漏率進行測定，不同時刻滲漏率的值為即時包封率與初始時刻包封率的差值?？梢杂^察到，溫度越高，脂質(zhì)體越易滲漏。放置于4℃的3批脂質(zhì)體，6個月后取樣觀察，無分層、沉淀及顏色變化，其粒徑、包封率和總體活性基本不變。

3 討論

逆相蒸發(fā)法[2]為制備大單層脂質(zhì)體或數(shù)層脂質(zhì)體較新的方法，特點是可包裹較大的水容積，適合于包裹水溶性藥物、大分子生物活性物質(zhì)，如胰島素、干擾素等。試驗表明，制備中水浴溫度及旋轉(zhuǎn)速度是整個制備方法的關(guān)鍵，并可能影響相關(guān)各項試驗的結(jié)果。同時，適當調(diào)節(jié)磷脂質(zhì)、有機溶劑、含藥緩沖液三者的比例，可獲得較高的包封率。包封率是脂質(zhì)體的一個重要質(zhì)量控制指標，脂質(zhì)體包封率的測定方法選用細胞病變抑制法[3]，既可測定包封率，也可測定其生物活性。因為是通過測定包裹的干擾素生物活性來確定包封率大小，故需要選擇適當?shù)牧呀鈩⒅|(zhì)體裂解，并使干擾素充分釋放出來。在裂解劑作用下，裂解劑和磷脂膜的相互作用，使得磷脂雙分子層被破壞，磷脂分子分散到溶液中，作用時間越長，裂解越充分。另外，隨著裂解劑的濃度增大，脂質(zhì)體顆粒裂解越來越充分，對干擾素活性的破壞也就有相應(yīng)增大的趨勢，故裂解劑濃度增大至2.0%后，測定的干擾素脂質(zhì)體活性不再繼續(xù)增加，甚至有下降趨勢。因此，選擇合適的裂解劑是客觀反映包封率和滲漏率的關(guān)鍵。

溫度對脂質(zhì)體的包裹和裂解也有著重要的影響，在2～8℃條件下，脂質(zhì)體滲漏率越小，穩(wěn)定性越好。因為溫度越低，磷脂分子在膜中的流動性越小，膜的穩(wěn)定性就越高，脂質(zhì)體顆粒間的融合以及破裂程度就越小，脂質(zhì)體顆粒之間相對穩(wěn)定性的增強，減小了脂質(zhì)體粒徑增大以及跨度變大的趨勢，從而降低了脂質(zhì)體的滲漏率。另外，有機物殘留量的多少，同樣可以反映出脂質(zhì)體制備工藝的好壞。因為干擾素是水溶性的大分子藥物，在制備的過程中受有機溶劑的影響而活性降低，所以應(yīng)盡量控制不必要的有機物殘留，以提高脂質(zhì)體產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性。

本試驗所建立的干擾素脂質(zhì)體的制備與質(zhì)控體系能夠較好地反映出所制備的樣品質(zhì)量。該方法操作比較簡便、易行，可信度高，適用于干擾素脂質(zhì)體的大生產(chǎn)。

[1]胡大強，陳 雅.干擾素脂質(zhì)體的研究進展[J].中國藥業(yè)，2001，10(9):58-59.

[2]陸 彬.藥物新劑型與新技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:130.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄56.