豬瘟DNA疫苗研究進(jìn)展

李娜，孫元，仇華吉

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001

1 DNA疫苗概述

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是 20世紀(jì)90年代Wolff等首創(chuàng)的新型疫苗[1]，本質(zhì)是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA (有時也可是RNA)，是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因而起到免疫保護(hù)作用。DNA疫苗是疫苗學(xué)發(fā)展的一個重要里程碑，是極有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N新型疫苗。

DNA疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn)：1) 在宿主體內(nèi)表達(dá)抗原過程中與自然感染相似，表達(dá)的抗原以天然構(gòu)像遞呈給宿主免疫系統(tǒng)，無抗原表位的改變。2) 克服了 MHC限制性，DNA免疫不僅可誘導(dǎo)對同類MHC的細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (Cytotoxic T lymphocytes，CTL) 應(yīng)答，同時也可以誘導(dǎo)在不同MHC間交叉的CTL應(yīng)答。3) DNA疫苗不僅能誘導(dǎo)體液免疫，更重要的是產(chǎn)生強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫[2-3]。4) 一般來說，外源DNA不會整合到寄主細(xì)胞的染色體中，因此應(yīng)用起來較安全穩(wěn)定[4]。目前尚未見DNA疫苗有常規(guī)疫苗和滅活疫苗可能產(chǎn)生的毒力“返祖”或殘留強(qiáng)毒入侵而引發(fā)疾病危險的報道。5) DNA疫苗不受母源抗體的影響，可產(chǎn)生很好的交叉反應(yīng)；誘導(dǎo)產(chǎn)生母源抗體，但不會被來源于母體的抗體所識別，因而在幼齡動物的早期免疫中具有十分重要的意義，可廣泛用于對許多疾病的早期預(yù)防[5-6]。6) 將多種質(zhì)粒DNA簡單混合，就可將生化特性類似的抗原 (如來源于相同病原菌的不同菌株) 或一種病原體的多種不同抗原結(jié)合在一起，組成多價疫苗，從而使一種DNA疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對多個抗原表位的免疫保護(hù)作用，使DNA疫苗生產(chǎn)的靈活性大大增加。

和減毒活疫苗相比，DNA疫苗安全性更高，因?yàn)樗簧婕芭c野毒可能重組的危險。而且質(zhì)粒DNA在動物體內(nèi)會緩慢降解，不會造成動物的自體免疫[7]，也不隨卵子和精子傳入子代體內(nèi)，它隨生物鏈進(jìn)入其他物種體內(nèi)時也會失活，而且對環(huán)境的污染很小，因此其危險性遠(yuǎn)低于現(xiàn)用疫苗。通常DNA疫苗僅攜帶病原體最具免疫原性的一個 cDNA，所以它可以被用于開發(fā)CSFV標(biāo)記疫苗。

近年來，許多畜禽病毒性傳染病已不能依靠傳統(tǒng)疫苗如滅活疫苗、弱毒疫苗等對其進(jìn)行防治，DNA疫苗的出現(xiàn)使得這一狀況得到改善。編碼病毒、細(xì)菌和寄生蟲等不同種類抗原基因的質(zhì)粒DNA，能夠引起脊椎動物如哺乳類、鳥類和魚類等多個物種產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的免疫反應(yīng)。DNA疫苗被稱為繼滅活疫苗和弱毒疫苗、亞單位疫苗之后的“第三代疫苗”，具有廣闊的發(fā)展前景。

2 豬瘟DNA疫苗的構(gòu)建和評價

2.1 常規(guī)DNA疫苗

目前關(guān)于豬瘟DNA疫苗國內(nèi)外均有報道。余興龍等[8]構(gòu)建了4種包含全長E2基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒，其中 pcDSW (含有信號肽序列) 質(zhì)粒肌肉注射小鼠后可誘導(dǎo)小鼠抗 CSFV的體液免疫，用pcDSW 免疫兔和豬后可獲得保護(hù)。在 Ganges等[9]的實(shí)驗(yàn)中，用 pCDNA-E2(TMR+E2) 免疫豬只，攻毒后除了一頭豬有輕微的臨床癥狀和病理變化外，另外兩頭豬得到了完全保護(hù)。Andrew等[10]最先評價了針對CSFV的DNA疫苗，將E2基因的全長cDNA克隆到質(zhì)粒載體pCI上。動物試驗(yàn)中，使用了不同的免疫方法和劑量。用無針注射器 (Panjet needleless) 接種耳朵，單次射擊200 μg pCI-gp55或兩次射擊50 μg pCI-gp55就足以誘導(dǎo)堅強(qiáng)的免疫力，保護(hù)所有免疫豬抵抗致死性CSFV的攻擊。然而，Hammond等[11]發(fā)現(xiàn)用100 μg pCI-gp55免疫兩次并沒有有效預(yù)防臨床癥狀或者是脾、淋巴節(jié)的損傷，最終僅有一半的豬存活下來。為了得到滿意的保護(hù)，對于 pCI-gp55高劑量和多次免疫似乎是必要的。而且，還需要采取一些策略來提高 pCI-gp55的免疫原性。

在評價候選標(biāo)記疫苗時，能否誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生常常被看作是一個重要的參數(shù) (劑量和產(chǎn)生時間)。在一些免疫攻毒試驗(yàn)中，DNA免疫后，中和抗體 (nAb) 產(chǎn)生水平的高低和免疫效力有很大的關(guān)系[10]，但也不全是這樣[9,11]。在 Andrew 等[10]和Hammond等[11]的研究中，在攻毒前所有產(chǎn)生中和抗體的豬都被保護(hù)了，然而，并不是所有存活下來的豬在攻毒前都有nAb的產(chǎn)生[10-11]。這暗示有可能涉及到nAb非依賴性的保護(hù)。Ganges等[9]發(fā)現(xiàn)攻毒前pCDNA3.1/E2 (CSFV的全長E2基因) 并沒有檢測到抗 CSFV抗體的產(chǎn)生，但是，它激活了特異性的MHC Ⅱ類限制的T細(xì)胞應(yīng)答。攻毒后，nAb的滴度在免疫豬體內(nèi)迅速升高，這個結(jié)果表明可以用誘導(dǎo)Th應(yīng)答的策略去設(shè)計標(biāo)記疫苗而不是直接誘導(dǎo)高滴度的中和抗體應(yīng)答。因此，攻毒前檢測不到免疫動物體內(nèi)的抗 CSFV中和抗體的存在就能較容易地區(qū)分感染動物和免疫動物。

在設(shè)計DNA疫苗時，E2蛋白跨膜區(qū) (TMR) 的作用是一個令人感興趣的話題。大多數(shù)豬瘟DNA疫苗研究采用全長 E2基因[9-13]，而在余興龍等[8]和Markowska-Daniel等[14]的研究中，帶有信號肽序列而沒有TMR的E2基因被用于構(gòu)建豬瘟DNA疫苗。余興龍等[8]的研究表明，質(zhì)粒 pcDSW (編碼不帶TMR的 E2基因) 能夠保護(hù)豬抵抗致死性的攻毒，但是質(zhì)粒pcDST (帶有TMR的E2基因) 誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答明顯弱于pcDSW誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Markowska-Daniel等[14]證實(shí)，gp55 pCIneo (含有TMR的E2基因) 不能保護(hù)免疫豬，然而 Sigp55pTargeT (含有不帶TMR的E2基因) 免疫豬除了僅有瞬時的低熱外都得到保護(hù)。這些看似矛盾的發(fā)現(xiàn)可能是由于他們之間的實(shí)驗(yàn)體系不同造成的。實(shí)際上，有或沒有TMR的E2基因DNA疫苗都是有效的候選疫苗。缺失跨膜區(qū)可以使抗原更容易分泌到細(xì)胞外的空間[15]，因而加強(qiáng)了體液免疫應(yīng)答。相比而言，包含TMR的全長E2基因的表達(dá)更傾向于將E2蛋白保留在細(xì)胞膜上遞送給T細(xì)胞。對于攜帶全長E2基因的質(zhì)粒，高免疫劑量似乎是產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答的一個重要因素。

2.2 新型DNA疫苗

近年來，甲病毒 (Alphaviruses) 尤其是Semliki Forest病毒 (Semliki Forest virus，SFV) 和Sindbis病毒 (SINV) 衍生的DNA/RNA載體被廣泛用于外源基因的表達(dá)。甲病毒復(fù)制子載體是衍生于RNA病毒基因組并能自主復(fù)制的RNA分子。RNA復(fù)制子疫苗是一種基于RNA復(fù)制子的新型疫苗，這種疫苗不會產(chǎn)生感染性病毒粒子，不會與細(xì)胞基因組發(fā)生整合，但能復(fù)制和表達(dá)外源性抗原基因，并誘導(dǎo)全身免疫和粘膜免疫及細(xì)胞免疫，因此非常安全有效。RNA復(fù)制子疫苗有幾種投遞方式：一是將RNA復(fù)制子包裝于病毒樣顆粒；二是體外轉(zhuǎn)錄成裸 RNA (RNA載體)；三是將復(fù)制子置于RNA聚合酶II啟動子控制下 (DNA載體)，由細(xì)胞RNA聚合酶II體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成RNA。

由甲病毒 (主要是 SFV或 SINV) 衍生的DNA/RNA復(fù)制型載體，由于具有安全、操作方便、表達(dá)外源基因效率高等特點(diǎn)，在基因免疫[16-17]和基因治療[18]中得到廣泛應(yīng)用。已經(jīng)證明，這種以復(fù)制子為基礎(chǔ)的DNA疫苗優(yōu)于常規(guī)DNA疫苗[17,19-25]。研究發(fā)現(xiàn)，這種疫苗表達(dá)效率的提高不止是因?yàn)橥庠纯乖磉_(dá)量的增多[21-26]。用復(fù)制子載體疫苗轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，其RNA復(fù)制酶合成大量雙鏈RNA (dsRNA)復(fù)制中間體，激活RNase L和RNA依賴的蛋白激酶(PKR)，導(dǎo)致被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡。dsRNA還可激活并誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞 (DC) 的成熟[27]，增加DC等抗原遞呈細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的攝取[28]。有研究證明，共轉(zhuǎn)染凋亡基因CD95/Fas或Caspase，可以增加常規(guī)基因疫苗的免疫原性和表達(dá)效率[29-30]。Leitner等用表達(dá)抗凋亡基因 Bcl-X(L) 的質(zhì)粒和表達(dá)黑色素瘤分化抗原TRP-1的SINV復(fù)制子載體一同遞送，雖然轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活時間變長，抗原表達(dá)量增加，體內(nèi)產(chǎn)生抗體提高，但由于干擾了細(xì)胞凋亡，大大降低了小鼠對于腫瘤攻擊的保護(hù)作用[31]。而經(jīng)同樣操作的常規(guī)DNA疫苗，其效力并不受Bcl-X(L)的影響。這些研究結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞凋亡在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中的重要作用，并為復(fù)制子疫苗通過細(xì)胞凋亡增強(qiáng)免疫反應(yīng)提供了強(qiáng)有力的佐證。dsRNA還可被天然免疫受體如Toll-like受體3(TLR-3) 或其他TLR識別，產(chǎn)生高水平的I型干擾素 (IFN-α和IFN-β) 或其他細(xì)胞因子，前者是宿主細(xì)胞在病毒感染后釋放的主要細(xì)胞因子[32-33]，對 DC的分化和成熟有重要促進(jìn)作用，在免疫應(yīng)答中起強(qiáng)大的佐劑作用，大大提高了復(fù)制子疫苗抗病毒或腫瘤的效應(yīng)。

鄧瑤等比較了不同劑量的SFV復(fù)制子載體疫苗pSCA-SSl的免疫效果，表明1 μg誘導(dǎo)的抗體滴度反而高于10 μg和100 μg兩個高劑量組[25]，說明對于pSCA這類復(fù)制型載體，免疫接種的質(zhì)粒DNA并不是越多越好，這也是由復(fù)制型載體的特性所決定的。正如上述，細(xì)胞凋亡是復(fù)制子疫苗免疫效率增強(qiáng)的必要條件[31]，但并非誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力越強(qiáng)，對激發(fā)的免疫反應(yīng)越有利。Sasaki等曾將表達(dá)流感病毒 HA基因的質(zhì)粒與表達(dá)部分滅活的突變 Caspase (可在誘導(dǎo)凋亡小體前表達(dá)抗原蛋白) 的質(zhì)粒聯(lián)合免疫小鼠，能顯著增強(qiáng) HA特異性免疫反應(yīng)，但與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的野生型 Caspase表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫卻不能增強(qiáng)免疫反應(yīng)[29]。另外，免疫質(zhì)粒劑量太多，宿主細(xì)胞攝入較多復(fù)制子質(zhì)粒后，產(chǎn)生大量dsRNA，迅速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，反而影響抗原的表達(dá)和處理，從而影響免疫效果。

此前有研究者構(gòu)建了基于SFV復(fù)制子載體、表達(dá)CSFV E2基因的新型DNA疫苗pSFV1CS-E2[34]，用此疫苗按600 μg/頭的劑量通過肌肉注射途徑免疫豬，共免疫3次，間隔3周，免疫豬產(chǎn)生了低水平的抗體，并且能抵抗致死性豬瘟強(qiáng)毒的攻擊[35]。鑒于前人報道的低劑量復(fù)制子疫苗可以誘導(dǎo)更好的免疫效果，同時出于成本考慮，研究者又嘗試用較低的免疫劑量 (100 μg/頭) 和較少的免疫次數(shù) (2次)[36]。這在已發(fā)表的以肌肉注射方式對 CSFV基因疫苗進(jìn)行效力評價的研究報道中，免疫次數(shù)和劑量都是最少的[8-10]。按此策略免疫豬只，二免后抗體水平持續(xù)上升至較高水平，攻毒后第2天起，抗體快速上升，表明產(chǎn)生了回憶性免疫應(yīng)答，攻毒豬均獲得了完全的臨床保護(hù)[36]。雖然RT-nPCR和熒光定量RT-PCR檢測個別豬攻毒后出現(xiàn)短期 (攻毒后第 4~6天) 病毒血癥，但病毒載量很低 (RT-nPCR第二輪擴(kuò)增才能檢出，病毒RNA含量不高于103拷貝/μL血液)，而對照組在攻毒后第 2天直到死亡 (或剖殺) 其血液中 CSFV拷貝數(shù)一直處于較高水平，表明復(fù)制子疫苗有效降低了病毒載量，縮短了病毒血癥。

2.3 新型給藥途徑和遞送工具

基因疫苗的給藥途徑比較簡單，大多是頸部或腿部肌肉內(nèi)注射、耳部皮下注射。但這些方法好像激發(fā)的免疫原性不夠好。比較新型的遞送工具包括針管注射 (Needle injection) 和生物彈射擊技術(shù)(Biolistic system)。針管注射容易操作，準(zhǔn)備注射用的DNA只要將其溶于鹽水中即可。生物彈射擊技術(shù)比如基因槍 (Gene gun) 或者生物噴射器 (Biojector)的優(yōu)勢在于其能提高免疫效力，已經(jīng)表明在小鼠實(shí)驗(yàn)中用生物彈射擊技術(shù)所用的 DNA比用針管注射技術(shù)低100倍劑量的DNA二者可以產(chǎn)生相當(dāng)?shù)目贵w免疫應(yīng)答[37-41]?；驑屆庖?，就是將DNA包被到金顆粒中，用基因槍將包被的DNA推進(jìn)到表皮。這種裝置推動包被DNA的金顆粒直接進(jìn)入表皮細(xì)胞，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答已經(jīng)在各種體系中得到驗(yàn)證[37,42]。在臨床試驗(yàn)中使用基因槍，使得所有用編碼乙型肝炎B抗原的DNA的疫苗免疫動物都發(fā)生了血清陽轉(zhuǎn)，甚至連那些對已經(jīng)合法化的重組蛋白疫苗沒有反應(yīng)的動物也出現(xiàn)血清陽轉(zhuǎn)[43-44]。

許多給藥途徑可以提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或者定位DNA到特異的細(xì)胞。這些給藥途徑包括定位到粘膜或者有益于轉(zhuǎn)染皮膚內(nèi)的朗罕氏細(xì)胞的推進(jìn)設(shè)施。粘膜噴射注水器 (無針注射器) (Jet injector) 已經(jīng)被用于HIV DNA疫苗的臨床試驗(yàn)[45-46]。定位到粘膜的好處是因?yàn)榇蟛糠植≡际峭ㄟ^粘膜進(jìn)入身體，所以經(jīng)粘膜給藥的疫苗可以產(chǎn)生更好的粘膜免疫應(yīng)答。電穿孔設(shè)備被評價可以極大地提高DNA的吸收和編碼蛋白的表達(dá)[47-48]。通過往體內(nèi)遞送小量的電流在細(xì)胞局部打孔，目的是為了使大部分被注射的DNA進(jìn)入到細(xì)胞。

將DNA封裝入或者封裝在載體上形成微粒[49-50]或者裝入細(xì)菌內(nèi)[51-52]是另一種保護(hù) DNA不被降解和/或者加強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞吸收的方法。這種方法可以增強(qiáng)對編碼蛋白的CTL應(yīng)答?？缮锝到獾姆强乖木廴樗峋哿u基乙酸 (PLGA或者 PLG) 微球體作為一個疫苗遞送體系有很多益處，抗原封裝到或者連接到PLG微球體上可以將細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)都激發(fā)出來。使用的微粒直徑大都在1~10 μm之間，這種尺寸的微粒很容易被樹突狀細(xì)胞和其他抗原遞呈細(xì)胞所吞噬[53]。通過在細(xì)胞間釋放抗原微球可以激發(fā)出CD8+和CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答[54]。微球遞送加強(qiáng)了針對DNA質(zhì)粒的免疫應(yīng)答[49,55]。

3 佐劑在豬瘟DNA疫苗中的應(yīng)用

為了提高DNA疫苗的免疫效果，研究者們選用了不少免疫佐劑來提高DNA疫苗的免疫原性。

用細(xì)胞因子作為佐劑也可以提高CSFV DNA疫苗的效力。Andrew等[12]發(fā)現(xiàn)共遞送IL-3或GM-CSF能夠加強(qiáng)pCI-gp55誘導(dǎo)的中和抗體滴度和保護(hù)力。Wienhold等[13]構(gòu)建了共表達(dá)CSFV E2蛋白和細(xì)胞因子 (IL-12、IL-18或CD-40L) 的嵌合質(zhì)粒，共表達(dá)IL-18或CD-40L的質(zhì)粒誘導(dǎo)了更堅強(qiáng)的免疫力，而共表達(dá) IL-12似乎降低了疫苗的效力 (中和抗體誘導(dǎo)更慢、滴度更低、保護(hù)力更差)。在研究BVDV的DNA疫苗中，Nobiron等發(fā)現(xiàn)用BVDV E2-DNA免疫小鼠[56-57]和牛[58]，共遞送的IL-2可以增強(qiáng)抗原特異性的免疫應(yīng)答。所以IL-2對于CSFV DNA疫苗來說可能是又一種有前景的細(xì)胞因子佐劑。在研究細(xì)胞因子的佐劑效應(yīng)時，必須謹(jǐn)慎，因?yàn)閷τ诓煌腄NA疫苗或不同的宿主佐劑的免疫效力也許差別很大。有時劑量也會影響到佐劑效應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)共遞送高劑量的IL-3在豬體內(nèi)會引起免疫抑制，而低劑量的IL-3會增強(qiáng)免疫[12]。

除了細(xì)胞因子，免疫刺激基序 CpG和 BCGDNA在DNA免疫中也是很好的佐劑。對幾種動物實(shí)驗(yàn)的研究表明，CpG寡核苷酸 (ODN) 可以加強(qiáng)和調(diào)節(jié)對抗原Th1/Th2的應(yīng)答[59]。Zang等發(fā)現(xiàn)共遞送BCG-DNA可以大大提高小鼠抗CSFV的抗體水平，但是很難影響E2-DNA誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答或IL-4和IFN-γ的產(chǎn)生[60]。

4 豬瘟DNA疫苗與其他疫苗的聯(lián)合應(yīng)用

Hammond等[10]采用 Prime-boost的方法，先用表達(dá)CSFV E2基因的裸露質(zhì)粒DNA pCI-gp55免疫斷奶仔豬 (6周齡) 和7日齡提前斷奶乳豬，然后這兩組豬群均用表達(dá) E2基因的腺病毒重組體(rPAV-gp55) 加強(qiáng)免疫1次，用CSFV攻毒后，斷奶豬沒有發(fā)熱癥狀，脾和淋巴結(jié)也沒有病理變化，并且100%的斷奶仔豬和75%的乳豬獲得保護(hù)。所有存活下來的6頭豬僅有1頭分離到了CSFV。用此免疫程序還可減少或阻止CSFV攻毒后豬只的排毒。

已有研究證實(shí)，采用Prime-boost策略可以提高復(fù)制子疫苗的免疫原性[61]。鑒于此，研究者用復(fù)制子疫苗pSFV1CS-E2初免，然后再用表達(dá)CSFV E2蛋白的重組腺病毒 (rAdV-E2) 加強(qiáng)免疫，結(jié)果表明，Prime-boost免疫后所有免疫豬都產(chǎn)生了高水平的 CSFV特異性的抗體，用 CSFV強(qiáng)毒攻擊后，rAdV-E2加強(qiáng)免疫豬沒有出現(xiàn)臨床癥狀，攻毒后也沒有檢出CSFV RNA，而同源pSFV1CS-E2加強(qiáng)免疫組部分豬出現(xiàn)發(fā)熱和病毒血癥。這證明異源性的Prime-boost是很有潛力的免疫策略[62]。

5 目前豬瘟DNA疫苗存在的問題和解決途徑

上述目前所有的豬瘟DNA疫苗主要存在2個問題：1) 免疫劑量大，免疫次數(shù)多，有時激發(fā)的免疫反應(yīng)弱，達(dá)不到所需的免疫效果。在余興龍等[8]對豬的免疫攻毒試驗(yàn)中，一次免疫就用了2.2 mg DNA疫苗pcDSW，共免疫3次，共用了6.6 mg DNA疫苗；在Ganges等[9]的研究中，共免疫3次，每次400 μg，共用了1.2 mg DNA疫苗；在Andrew等[10]的報道中，同時比較了幾種方式的免疫方法，最后還是確定肌肉注射1 mg DNA疫苗pCI-gp55免疫效果最好。2) 導(dǎo)入細(xì)胞和機(jī)體的效率差，抗原表達(dá)水平低，接種 CSFV基因疫苗后，免疫動物出現(xiàn)特異性免疫應(yīng)變反應(yīng)較慢，血清中的抗體水平亦不很高，這與多數(shù)疫病的基因疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)類似[7]。一般說基因疫苗可誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，是相對于疫苗質(zhì)粒接種后在體內(nèi)的抗原表達(dá)量而言的(表達(dá)量只是ng水平)。因此，提高接種后疫苗質(zhì)粒在機(jī)體中的抗原表達(dá)量，是目前基因疫苗研究領(lǐng)域中的重要課題之一[63]。

針對以上兩種缺陷，研究者們采用了很多方法去克服豬瘟DNA疫苗的不足。比如用細(xì)胞因子、免疫刺激基序CpG和BCG-DNA等作為佐劑來加強(qiáng)豬瘟DNA疫苗的免疫效力。用Prime-boost的策略來增強(qiáng)豬瘟DNA疫苗的效力 (前文已述及)。

以甲病毒 (主要是 SFV) 衍生的復(fù)制子疫苗(亦即“自殺性”DNA疫苗) 是解決常規(guī)DNA疫苗用量較大的策略之一。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)對于這類復(fù)制型載體免疫接種的質(zhì)粒DNA并不是越多越好，這是由其復(fù)制型載體的特性決定的。已有研究者證實(shí)免疫100 μg復(fù)制型DNA疫苗pSFV1CS-E2兩次，攻毒后免疫豬從臨床上獲得了完全保護(hù)。盡管甲病毒為基礎(chǔ)的載體能高效表達(dá)外源蛋白，但是由于其復(fù)制對宿主細(xì)胞造成的強(qiáng)烈毒性，抑制宿主細(xì)胞蛋白的合成，導(dǎo)致細(xì)胞過早調(diào)亡，致使外源基因不能持續(xù)表達(dá)，不利于外源蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫細(xì)胞對其的加工呈遞[64]。為了克服這一缺陷，筆者構(gòu)建了基于pSFV1CS-E2的編碼CSFV E2蛋白和偽狂犬病病毒(PRV) VP22的融合蛋白的質(zhì)粒 pSFV1CS-E2-UL49[65]，經(jīng)證實(shí)，PRV UL49基因的編碼蛋白VP22，是一種重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo) (Protein transduction) 功能，能將與之融合表達(dá)的綠色熒光蛋白在無任何輔助條件介導(dǎo)下 (如脂質(zhì)體、磷酸鈣、電轉(zhuǎn)化、病毒載體等) 直接導(dǎo)入細(xì)胞[66]。在Zhao等[65]的研究中，將pSFV1CS-E2和pSFV1CSE2-UL49誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫 (CMI) 在小鼠模型上進(jìn)行了評價，結(jié)果表明這兩種疫苗都能誘導(dǎo)CSFV特異的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且pSFV1CS-E2-UL49比pSFV1CS-E2誘導(dǎo)了更強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和更高的細(xì)胞因子水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，甲病毒復(fù)制子衍生的 DNA疫苗能夠誘導(dǎo)CMI，而且PRV VP22能夠增強(qiáng)共遞送抗原的免疫原性。上述的Prime-boost實(shí)驗(yàn)表明此方法也是提高復(fù)制子疫苗的策略之一。

6 小結(jié)

總之，對于CSFV標(biāo)記疫苗來說，DNA免疫是其中非常有前景的策略。到目前為止，所有的豬瘟候選DNA疫苗都是利用E2蛋白作為免疫原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，Erns作為新成員也可以用于開發(fā)DNA疫苗。高劑量多次免疫和共遞送細(xì)胞因子或免疫刺激基序佐劑或采用Prime-boost的策略，是提高DNA疫苗效力的切實(shí)可行的方法。但目前的實(shí)驗(yàn)室研究中，首次免疫E2-DNA疫苗和實(shí)驗(yàn)性攻毒的時間間隔長于其他候選疫苗，如果在DNA免疫后不能很快產(chǎn)生堅強(qiáng)的免疫力，長的“窗口期”將會成為DNA疫苗在現(xiàn)地應(yīng)用中非常不利的因素[67](圖1)。

圖1 檢測 (A) 和保護(hù) (B) 的“窗口期”(Ab(nm)：針對陰性標(biāo)記的抗體應(yīng)答；Ab(pm)：針對陽性標(biāo)記的抗體應(yīng)答)[67]Fig. 1 “Window phase” for detection (A) or protection (B). Ab(nm): antibodies response against negative marker; Ab(pm): antibody response against positive marker[67].

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