blaTEM-116型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)、純化及其應(yīng)用

王震，鄭穎，范泉水，陳秀樞，呂建新

1 溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)與生命科學(xué)學(xué)院 微生態(tài)學(xué)研究所，溫州 325035

2 成都軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，昆明 650032

超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶 (Extended-spectrum βlactamase，ESBL) 是細(xì)菌在超廣譜β-內(nèi)酰胺抗生素選擇壓力下產(chǎn)生的一類耐藥酶，能夠降解大部分青霉素類、3代以下頭孢菌素類的 β-內(nèi)酰胺抗生素，主要機(jī)制是水解該類抗生素母環(huán)的酰胺鍵而導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性。TEM型ESBL是一種主要的亞群，攜帶blaTEM，由blaTEM-1或blaTEM-2發(fā)生一個(gè)或數(shù)個(gè)位點(diǎn)的突變而形成具有不同底物譜的TEM型ESBL。與TEM-1酶相比，TEM-116 ESBL存在著2個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變(Val 84→Ile，Ala 184→Val)，使其底物輪廓具備超廣譜酶的特征，具有分解絕大部分 β-內(nèi)酰胺類抗生素的能力[1-2]。自2002年Vignoli等[1]報(bào)道自臨床樣本分離出攜帶blaTEM-116的Escherichia coli以來(lái)，世界各地不斷發(fā)現(xiàn)產(chǎn)TEM-116 型ESBL的流行株[3]。

β-內(nèi)酰胺類藥物是應(yīng)用廣泛的抗生素，涉及醫(yī)療業(yè)、制藥業(yè)、農(nóng)業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域。因此，在某些特定外環(huán)境中存在著大量未經(jīng)降解的該類抗生素，如制藥廠排出的工業(yè)發(fā)酵廢水、病人排泄物和醫(yī)源性污水、食品制造業(yè)的奶制品與肉制品等都可能涉及抗生素污染問(wèn)題，從而導(dǎo)致耐藥菌株的形成與流行。因此，抗生素對(duì)環(huán)境、食品、醫(yī)療場(chǎng)所的污染與耐藥菌的傳播，以及醫(yī)院內(nèi)感染等問(wèn)題已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注[4-8]。

本研究采用“逆向思維”的科學(xué)方法，把TEM-116 ESBL這種具有超廣譜特征的耐藥酶開(kāi)發(fā)成具有潛在應(yīng)用價(jià)值的工具酶，用于清除醫(yī)源性排泄物、藥廠工業(yè)性發(fā)酵廢液中的β-內(nèi)酰胺抗生素，在其經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的安全性評(píng)價(jià)并經(jīng)監(jiān)管部門(mén)批準(zhǔn)的前提下，結(jié)合酶固定化技術(shù)有望用于清除液態(tài)食品中的 β-內(nèi)酰胺抗生素，并嘗試性地將其用于降解體內(nèi)青霉素G。通過(guò)構(gòu)建高效表達(dá)的TEM-116 ESBL原核工程菌，對(duì)其發(fā)酵、表達(dá)及純化條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)TEM-116 ESBL的酶動(dòng)力學(xué)特性和應(yīng)用于特定樣本的可行性進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，初步證明其具備工具酶的穩(wěn)定特征，為進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

含pUCm-TEM-116質(zhì)粒的E. coli DH5α菌株、金黃色葡萄球菌ATCC 25923標(biāo)準(zhǔn)株由溫州醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子醫(yī)學(xué)研究所提供；blaTEM-116(AY425988)來(lái)自溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院微生物科保存的產(chǎn)ESBL的 E. coli臨床株；原核表達(dá)載體pET-28a及宿主菌E. coli BL21(DE3) 購(gòu)自美國(guó)Novagen 公司。

1.2 酶及主要試劑

限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XhoⅠ、Taq酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Sephacryl S100 (XK 50/100)、Ni2+-NTA瓊脂糖 (XK 16/20)、Sephadex G25 (XK 50/100)、DE-52 (XK 26/40) 購(gòu)自GE Healthcare；戴爾沃 (Delvotest SP) β-內(nèi)酰胺類抗生素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Gist-Brocades；青霉素G (Penicillin G，PG)、氨芐青霉素 (Ampicillin，Amp)、阿莫西林 (Amoxicillin，AMXC)、哌拉西林 (Piperacillin，PIPC)、頭孢氨芐(Cephalexin，CEL )、頭孢唑林 (Cefazolin，CEZ)、頭孢哌酮(Cefoperazone，CPZ)、頭孢噻肟 (Cefotaxime，CTX) 等抗生素均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；天然TEM-ESBL酶為自行表達(dá)與純化；青霉素發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液按文獻(xiàn)[9]方法配制。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將 pUCm-TEM-116和 pET28a質(zhì)粒分別進(jìn)行NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收純化，用T4 DNA 連接酶于 16℃連接 3 h，然后轉(zhuǎn)化 E. coli BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化菌涂布于含30 μg/mL卡那霉素的 LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切、電泳鑒定，提取的質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序。

1.4 blaTEM-116的表達(dá)、復(fù)性、純化及理化性質(zhì)檢測(cè)

1.4.1 blaTEM-116的表達(dá)、復(fù)性和純化

重組菌接種于70 mL LB培養(yǎng)基 (含30 μg/mL卡那霉素) 中，于37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)11 h。次日，70 mL種子接種于含7 L的LB培養(yǎng)基 (含30 μg/mL卡那霉素)的發(fā)酵罐，發(fā)酵罐設(shè)置參數(shù)為：37℃；溶氧率45%；pH 7.0。當(dāng)菌體生長(zhǎng)至OD600為1.7~1.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，待菌體濃度不再升高1 h后，開(kāi)始撤罐，離心收集菌體。

細(xì)菌懸浮于PBS (20 mmol/L，pH 7.4)，超聲裂解，于4℃、15 000 r/min離心15 min，取沉淀用包涵體洗滌液 (10 mmol/L EDTA，0.5% Triton X 100，pH 8.0)重懸，室溫放置5 min，15 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀溶于100 mL包涵體裂解液 (8 mol/L urea，10 mmol/L DTT，pH 7.4)，以打開(kāi)目的蛋白中錯(cuò)配二硫鍵。室溫放置30 min后，用?KTA explore蛋白純化儀純化，先進(jìn)行 Ni2＋-NTA瓊脂糖親和層析柱(XK16/20)純化，Binding buffer (5 mmol/L imidazole，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，20 mmol/L Tris-HC1，pH 8.0) 為上樣緩沖液，每次取10 mL裂解液，以1 mL/min流速緩慢經(jīng)過(guò)Binding buffer平衡后的親和層析柱，以便目的蛋白充分復(fù)性、結(jié)合。用 Wash buffer (0.5 mol/L NaCl，60 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9) 洗去雜蛋白，再用10 mL Elute buffer (1 mol/L imidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9) 洗脫復(fù)性目的蛋白，該洗脫液再進(jìn)行分子篩層析純化，洗脫液上樣于經(jīng) 10 mmol/L NaH2PO4-Cit緩沖液(pH 6.6) 預(yù)平衡的Sephacryl S-100 (XK50/100) 柱，繼續(xù)用該緩沖液以5 mL/min的速度洗脫，最后目的蛋白收集液以Sephadex G25 (XK50/100) 柱脫鹽，收集液凍干、復(fù)溶后，進(jìn)行酶的活性檢測(cè)、SDS-PAGE電泳及其bandscan V5.0蛋白掃描分析軟件分析純度。

產(chǎn)酶天然菌發(fā)酵液加Amp至終濃度30 μg/mL，不加誘導(dǎo)劑，其他發(fā)酵條件同重組菌。細(xì)菌離心后所得裂解液上清共 100 mL，加硫酸銨至 45%飽和度，靜置15 min，15 000 r/min 離心15 min，取上清加硫酸銨至75%飽和度，離心15 min，沉淀重新溶于 100 mL的 10 mmol/L NaCl、10 mmol/L NaH2PO4-Cit (pH 7.0) 混合溶液中，沉淀溶解液上樣于經(jīng)同一緩沖液液平衡的陰離子交換柱 DE-52 (XK26/40)，以梯度10~300 mmol/L NaCl的10 mmol/L NaH2PO4-Cit (pH 7.0) 混合液進(jìn)行梯度洗脫，取收集峰中段活性最高的小部分溶液，對(duì)其隨后進(jìn)行的Sephacryl S-100、Sephadex G25層析、脫鹽及其凍干同上。

1.4.2 TEM-116 ESBL理化性質(zhì)檢測(cè)

TEM-116 ESBL 委托上?；倒具M(jìn)行N末端氨基酸測(cè)序。

Bradford法測(cè)定蛋白含量[10]，紫外吸收法測(cè)定酶對(duì)底物的水解率[11]。以PG為底物，0.1 mol/L pH 7.0的PBS為緩沖液，OD233時(shí)測(cè)定PG吸光度變化，計(jì)算酶活性。一個(gè)國(guó)際單位 (IU) 酶活性定義為pH 7.0、37℃條件下，每分鐘水解1 mmol底物的酶量。

1.5 TEM-116 ESBL動(dòng)力學(xué)特性檢測(cè)

重組、天然TEM-116 ESBL和抗生素均以PBS (0.01 mol/L、pH 7.0)溶解，在200~400 nm 紫外區(qū)間進(jìn)行掃描，確定測(cè)定波長(zhǎng)。根據(jù)Lee-Wilson 的改良雙倒數(shù)方程標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)，求Km與Vmax，根據(jù)反應(yīng)體系中加入酶量計(jì)算Kcat及其他衍生參數(shù)[3]。

1.6 TEM-116 ESBL降解環(huán)境中β-內(nèi)酰胺類藥物的應(yīng)用

1.6.1 模擬藥廠發(fā)酵廢液與病人尿液中β-內(nèi)酰胺類藥物的清除

向青霉素發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入PG，使其濃度分別為1000 mg/L和7000 mg/L，模擬制藥廠青霉素發(fā)酵液 (pH 6.0)；向尿液中加入等量的 Amp、PG和CEZ混合液，使其終濃度分別為8 mg/L和200 mg/L，模擬含抗生素的病人尿液 (pH 5.5)。向上述樣本中加入不同量的TEM-116 ESBL，25℃下分別降解12 h和2 h。取降解后的樣本0.1 mL，經(jīng)Delvotest SP法[12]確認(rèn)是否有抗生素殘留。

1.6.2 液態(tài)牛奶中PG的清除

不含抗生素的新鮮液態(tài)牛奶中加入 PG至終濃度為80 U/L，考慮到實(shí)際應(yīng)用的簡(jiǎn)便性，設(shè)計(jì)3個(gè)溫度條件為4℃、25℃和37℃，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 IU的TEM-116 ESBL，作用0.5 h后，經(jīng)Delvotest SP法確認(rèn)是否有抗生素殘留。

1.6.3 小鼠體內(nèi)青霉素G的清除

將30只昆明鼠隨機(jī)分成6組，每組5只，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，給以藥物和酶的劑量如下：第1組：空白對(duì)照組；第2組：PG 200 μg (8.0~9.1×103μg /(kg·bw))；第 3組：PG 200 μg +200 IU TEM-116 ESBL (8.0×103~9.1×103IU/(kg·bw))；第4組：PG 200 μg+ 300 IU TEM-116 ESBL (1.2×104~1.4×104IU/(kg·bw))；第5組：PG 2000 μg (8.0×104~9.1×104μg /(kg·bw))+ 400 IU TEM-116 ESBL (1.6×104~1.8×104IU/(kg·bw))；第 6組：PG 2000 μg +500 IU TEM-116 ESBL (2.0×104~ 2.3×104IU/(kg·bw))。

實(shí)驗(yàn)鼠尾靜脈注射0.2 mL不同濃度的PG，0.5 h后，再注射不同濃度的TEM-116 ESBL溶液，10 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，取四肢的肌肉，無(wú)菌雙蒸水洗凈，吹干，取約2 g剪碎的組織放入4 mL EP管內(nèi)，加1 mL無(wú)菌雙蒸水，勻漿1 min，14 000 r/min離心5 min，取0.1 mL上清液經(jīng)Delvotest SP法檢測(cè)是否有PG殘留，每組2只進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 pET28-TEM-116重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒的構(gòu)建如圖1所示，該方法保證了重組表達(dá)的TEM-116 ESBL在pET 28a質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子控制下，形成 6×His的融合蛋白。工程菌中提取的重組質(zhì)粒經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切后得到863 bp和5235 bp兩條片段 (圖2)。酶切圖譜與預(yù)期結(jié)果完全一致，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序，確證blaTEM-116已成功克隆至pET28表達(dá)載體上。

2.2 blaTEM-116的高效表達(dá)、復(fù)性、純化及理化性質(zhì)檢測(cè)

2.2.1 blaTEM-116的高效表達(dá)、復(fù)性和純化

濕重為45 g的細(xì)菌所制備的TEM-116 ESBL包涵體先后經(jīng)親和及分子篩層析的純化與復(fù)性。在親和層析后，洗脫液蛋白紫外吸收峰 (圖 3A) 可見(jiàn) 2個(gè)峰，峰1分子量較大，推測(cè)為前體TEM-116 ESBL峰 (32 kDa)，峰2分子量較小，推測(cè)為成熟TEM-116 ESBL峰 (30 kDa)。其洗脫液經(jīng)Sephacryl S100分子篩純化后，分別收集峰1和峰2蛋白，再經(jīng)Sephadex G25脫鹽后，獲得69.2 mg、比活性為476 IU/mg的成熟TEM-116 ESBL，即目的蛋白(洗脫峰見(jiàn)圖3B)。另一純化的前體 TEM-116 ESBL經(jīng)測(cè)定比活性為39 IU/mg。

圖1 重組質(zhì)粒pET28-TEM-116的構(gòu)建Fig. 1 Construction of the recombinant plasmid of pET28-TEM-116.

圖2 重組質(zhì)粒pET28-TEM-116的雙酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant pET28-TEM-116 digested with Nco I and Xho I. M: DL 15000 marker; 1: pET28-TEM-116 digested with Nco I and Xho I.

經(jīng)SDS-PAGE電泳，親和層析純化前后的樣品(圖4，泳道2和3) 同時(shí)存在30 kDa和32 kDa兩個(gè)蛋白條帶，表明它們都含有 His標(biāo)簽；分子篩層析分離的蛋白條帶 (圖4，泳道1和4) 證明其分子量分別為30 kDa 和32 kDa；上述結(jié)果與預(yù)期一致。經(jīng)蛋白掃描分析軟件分析圖4之泳道1和4，蛋白條帶純度均達(dá)到90%以上。

2.2.2 TEM-116 ESBL的 N末端測(cè)序

圖3 重組TEM-116 ESBL的洗脫曲線 (280 nm)Fig. 3 Protein trace (continuous line, 280 nm) during elution of the recombinant TEM-116 ESBL. (A) Protein trace (continuous line, 280 nm) during elution of the recombinant TEM-116 ESBL from the Ni2＋-NTA affinity chromatograph column (AU=absorbance units). 1: the precursor TEM-116 ESBL(32 kDa, 39 IU/mg); 2: the mature TEM-116 ESBL (30 kDa, 476 IU/mg). (B) Protein trace (continuous line, 280 nm;) of desalting the mature TEM-116 ESBL from the Sephadex G 25 column during elution.

圖3A中峰2與圖3B相應(yīng)所純化的TEM-116 ESBL經(jīng)測(cè)序，其N端前9個(gè)氨基酸分別為HPETLVKVK，與推導(dǎo)的及GenBank所公布的成熟TEM-116 ESBL (Accession No. AY425988) N端氨基酸完全一致。表明高活性的30 kDa酶蛋白為成熟TEM-116 ESBL。本研究中動(dòng)力學(xué)特性及其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)均采用該重組蛋白。

2.3 TEM-116 ESBL的動(dòng)力學(xué)特性

圖4 SDS-PAGE檢測(cè)純化的TEM-116 ESBLFig. 4 SDS-PAGE analysis of the purified TEM-116 ESBL from inclusion bodies. M: protein marker; 1: purified mature TEM-116 ESBL; 2: inclusion bodies after dialysis; 3: inclusion bodies after affinity chromatography; 4: purified precursor TEM-116 ESBL.

自行分離純化的天然TEM-116 ESBL的比活性為461 IU/mg，與重組酶的比活性 (476 IU/mg) 相近，用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)兩種酶的Km、Kcat、Kcat/Km三項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)，結(jié)果表明 (表1)，天然酶與重組 TEM-116 ESBL的 Km(t=1.334，P= 0.202)、Kcat(t=1.362，P=0.193)、Kcat/Km(t=1.479， P= 0.160)，無(wú)顯著性差異。TEM-116 酶對(duì) CPZ親和力最高，表明 CPZ是該酶的最優(yōu)底物，其次是CEL。用催化常數(shù)評(píng)價(jià)，該酶對(duì)AMXC、Amp和PG的催化遠(yuǎn)高于其他頭孢類藥物，表明在底物飽和的情況下，對(duì)青霉素類具有較快的轉(zhuǎn)化率；而頭孢菌素中，則對(duì)CEZ具有較高的催化效率，但仍遠(yuǎn)小于Amp。就綜合效率參數(shù)Kcat/Km而言，青霉素類藥物是最容易被TEM-116 ESBL所降解的抗生素。這些均說(shuō)明：重組和天然TEM-116 ESBL之間在酶催化動(dòng)力學(xué)方面無(wú)顯著差異；且該酶具有超廣譜酶的底物譜、對(duì)底物的親和力 (Km) 較強(qiáng)；同時(shí)，其催化效率 (Kcat) 也表明它具備較好的工具酶特征。

2.4 TEM-116 ESBL降解環(huán)境中β-內(nèi)酰胺類藥物的應(yīng)用

2.4.1 模擬藥廠發(fā)酵液與尿液中β-內(nèi)酰胺類藥物的清除

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 (表2)：25℃下作用12 h后，5.0 IU TEM- 116 ESBL可清除1 L模擬發(fā)酵液 (pH 6.0) 中的1000 mg PG，10.0 IU 該酶可清除1 L發(fā)酵液中的7000 mg PG；而25℃下作用2 h，5.0 IU 該酶可清除1 L模擬病人尿液 (pH 5.5) 中Amp、PG和CEZ各為8 mg 的混合抗生素，320.0 IU TEM-116 ESBL可清除1 L尿液中的Amp、PG、CEZ各為200 mg混合抗生素。表明該酶在不同應(yīng)用介質(zhì)中具有穩(wěn)定的活性，能夠高效地降解模擬發(fā)酵液、病人尿液中β-內(nèi)酰胺類藥物。

表1 天然與重組TEM-116 ESBL的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of native and recombinant TEM-116 ESBL

表2 TEM-116 ESBL清除發(fā)酵液 (pH 6.0) 及尿液(pH 5.5) 中的β-內(nèi)酰胺抗生素Table 2 Elimination of β-lactam antibiotics in fermental liquid medium(pH 6.0)and urine(pH 5.5) by TEM-116 ESBL

表3 TEM-116 ESBL清除牛奶中的PG (80 U/L PG，0.5 h)Table 3 Elimination of PG in milk by TEM-116 ESBL (80 U/L PG, 0.5 h)

2.4.2 牛奶中PG的清除

牛奶中添加PG至終濃度為80 U/L，分別在4℃、25℃和37℃下作用0.5 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 (表3)：1.0、1.5和2.5 IU TEM-116酶分別在4℃、25℃和37℃溫度條件下，經(jīng)0.5 h清除牛奶中80 U/L的 PG。

2.4.3 小鼠體內(nèi)PG的清除

由表4可見(jiàn)，1.2×104~1.4×104IU/(kg·bw) 酶能夠完全清除 8.0×103~9.1×103μg/(kg·bw) 的 PG；2.0×104~2.3×104IU/(kg·bw) 酶可完全清除 8.0×104~ 9.1×104μg/(kg·bw) 的PG。各組留觀20 d的小鼠未見(jiàn)異常死亡。該結(jié)果表明TEM-116 ESBL作為一種小分子蛋白 (30 kDa)，能夠通過(guò)血管屏障，并在體內(nèi)仍保留一定的活性。

3 討論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)，將TEM-116 ESBL進(jìn)行包涵體表達(dá)，并建立了實(shí)驗(yàn)室中試規(guī)模的表達(dá)與純化的技術(shù)路線，濕重45 g細(xì)菌的包涵體，經(jīng)系列步驟純化，共獲取69.2 mg (476 IU/mg，計(jì)32 939 IU)TEM-116 ESBL。相比較復(fù)雜的包涵體復(fù)性，通過(guò)與純化同步的柱上復(fù)性則得以簡(jiǎn)化。此外，實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了TEM-116 ESBL所含的信號(hào)肽能被細(xì)菌水解酶所切割，從而形成前體和成熟TEM-116 ESBL兩種酶蛋白。實(shí)驗(yàn)中獲取的前體 TEM-116 ESBL (32 kDa，39 IU/mg)活性較低，可能的原因是前體和成熟酶蛋白半胱氨酸數(shù)目差異而導(dǎo)致的復(fù)性率不同，如成熟酶蛋白有2個(gè)半胱氨酸，復(fù)性時(shí)只能形成1個(gè)二硫鍵；而前體酶蛋白有3個(gè)半胱氨酸，復(fù)性需形成3個(gè)正確配對(duì)的二硫鍵，導(dǎo)致酶的復(fù)性率較低。因此，若進(jìn)一步的研究中實(shí)現(xiàn)將更多的前體酶蛋白轉(zhuǎn)換為成熟酶蛋白，該酶的復(fù)性率很可能顯著提高。

表4 TEM-116 ESBL清除小鼠體內(nèi)的PGTable 4 Elimination of eliminating PG in vivo mouse by TEM-116 ESBL

抗生素的發(fā)明和應(yīng)用是人類戰(zhàn)勝感染性疾病的最有力武器，但是，在醫(yī)療、預(yù)防、工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的廣泛使用乃至濫用也給人類帶來(lái)了嚴(yán)重的生物安全問(wèn)題，如人體和環(huán)境中的病原微生物耐藥性形成與互相傳播呈高發(fā)趨勢(shì)[3-7]，最近，Pellegrini等報(bào)道在城市污水和醫(yī)療環(huán)境中的假單胞菌屬中分離出一種新型的具有超廣譜特征的金屬型內(nèi)酰胺酶變種——IMP 22酶[13]。另外，在歐洲地區(qū)的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬細(xì)菌具有很高的 ESBL產(chǎn)生率[14]，而這些菌屬都是臨床最常見(jiàn)的致病菌。因此，探尋有效遏制環(huán)境相關(guān)微生物耐藥性傳播的手段是非常必要的。本研究初步證明TEM-116 ESBL對(duì)模擬的青霉素藥廠生產(chǎn)性廢液 (pH 6.0) 和模擬的 β-內(nèi)酰胺類抗生素治療病人尿液 (pH 5.5) 中所含的青霉素類和頭孢菌素類藥物都具有較高的降解效率，其中，5.0 IU和10.0 IU的酶在25℃條件下作用12 h，能夠分別降解發(fā)酵廢液中所含的1000 mg/L與7000 mg/L的PG；Amp、PG和CEZ各為8 mg/L和200 mg/L的病人尿液樣本中的混合抗生素，僅分別需要5.0 IU和320.0 IU TEM-116 ESBL即可完全清除。酶的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明該酶對(duì)絕大部分 β-內(nèi)酰胺藥物具有較高和較穩(wěn)定的催化效率，且重組酶和天然酶在酶動(dòng)力學(xué)的Km、Kcat、Kcat/Km等參數(shù)方面相近。這些結(jié)果提示，可以將TEM-116 ESBL開(kāi)發(fā)成環(huán)境保護(hù)制劑應(yīng)用于消除高 β-內(nèi)酰胺抗生素污染的相關(guān)領(lǐng)域，從而達(dá)到有效遏制環(huán)境相關(guān)病原微生物耐藥性形成與傳播的目的。

由于抗生素在動(dòng)物飼料、生長(zhǎng)促進(jìn)劑、疾病治療與預(yù)防等方面具有獨(dú)特的作用，因此，動(dòng)物源性食品中抗生素的殘留和污染也是廣泛存在的生物安全與食品安全問(wèn)題[15-16]。如我國(guó)奶牛的乳腺炎等疾病發(fā)病率高，PG為代表的β-內(nèi)酰胺類抗生素由于價(jià)廉、有效，為廣大奶農(nóng)作為首選治療用藥，用藥期間及其后的一段時(shí)間牛奶中產(chǎn)生高濃度的抗生素，此外，部分飼料中也可能被抗生素污染或人為添加，因此，短期內(nèi)還不能從源頭上杜絕抗生素對(duì)牛奶的污染。早在1985年，Korycka-Dahl M等就使用粗制的β-內(nèi)酰胺酶分解殘留于牛奶中的 PG，但是，由于酶的來(lái)源為天然粗制酶，所以，其生物安全性和酶的活性都不理想[17]。本實(shí)驗(yàn)利用重組TEM-116 ESBL成功地降解了奶樣中的 PG，但由于目前 TEM-116 ESBL尚處于安全性評(píng)價(jià)階段，故不推薦實(shí)際應(yīng)用。而通過(guò)運(yùn)用酶固定化技術(shù)，可在不向牛奶中直接投放酶添加劑的基礎(chǔ)上清除 β-內(nèi)酰胺抗生素，該技術(shù)的應(yīng)用有望使該工具酶較早通過(guò)食品藥監(jiān)部門(mén)的認(rèn)定，而進(jìn)入實(shí)用階段。為了進(jìn)一步證明 TEM-116 ESBL這種小分子酶蛋白是否具備體內(nèi)分解 PG能力，研究中進(jìn)行了小鼠體內(nèi)藥物降解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1.2×104~1.4×104IU/(kg·bw) 酶能完全清除 8.0×103~ 9.1×103μg/(kg·bw) 的PG；2.0×104~2.3×104IU/(kg·bw)酶可完全清除8.0×104~9.1×104μg/(kg·bw) 的PG。每組2只留觀鼠經(jīng)20 d觀察，未見(jiàn)異常死亡。該結(jié)果表明TEM-116 ESBL作為30 kDa的小分子蛋白，能夠通過(guò)血管屏障，并在體內(nèi)呈現(xiàn)其酶的活性。關(guān)于把 ESBL作為新型食品添加 (處理) 劑的安全性問(wèn)題，筆者認(rèn)為涉及兩個(gè)方面，其一是酶自身的安全，其二是分解產(chǎn)物的安全。由于該酶是由耐藥菌產(chǎn)生，因此，在人體的胃腸道、呼吸道、陰道等微生態(tài)區(qū)域均天然存在，故亦不應(yīng)有酶自身或免疫學(xué)方面的危害；而關(guān)于抗生素分解后次級(jí)產(chǎn)物的毒副作用問(wèn)題，有必要進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，或者通過(guò)優(yōu)化技術(shù)手段如固定化酶膜等方法加以克服。

總之，本研究采用“逆向思維”的科學(xué)方法，把 ESBL由廣泛存在于體內(nèi)微生態(tài)菌叢中的耐藥酶轉(zhuǎn)化為具有潛在應(yīng)用價(jià)值的工具酶，并取得了實(shí)驗(yàn)支持，為其進(jìn)一步的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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