芹菜素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌核轉(zhuǎn)錄因子-κB和 ICAM-1表達(dá)的影響

張慧芝 白建平 于肯明

(山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室,037009)

在心血管疾病治療過(guò)程中,許多常用和新發(fā)展的治療措施都不可避免地造成缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury,IRI),因此缺血再灌注時(shí)的心肌保護(hù)越來(lái)越成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)[1]是近年來(lái)研究較多并取得顯著進(jìn)展的一種核轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控著炎性細(xì)胞因子和粘附分子的表達(dá),被認(rèn)為是缺血心肌保護(hù)的一個(gè)新治療靶點(diǎn)。芹菜素 (Apigenin,Api)是天然抗氧化劑,廣泛存在于芹菜、蘋果、桔子、車前子、絡(luò)石藤、藿香等植物中,具有多種藥理學(xué)作用,已成為藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用芹菜素預(yù)處理觀察大鼠缺血再灌注時(shí)心肌組織內(nèi)NF-κB和粘附分子ICAM-1的變化,探討芹菜素抗心肌IRI的可能機(jī)制。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)藥物 芹菜素:純度≥98%,陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司,批號(hào):AP20050727。實(shí)驗(yàn)時(shí)芹菜素用聚乙二醇400(PEG400)和無(wú)水乙醇40℃水浴40min藥物溶解后,再用生理鹽水稀釋為含10%的PEG400和10%的乙醇溶液。臨用前配制。

2.動(dòng)物 Wistar大鼠60只,雌雄各半,體重220-250g,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2005-0013。

3.試劑與儀器 即用型 SABC (貨號(hào)SA1022)、NF-κB p65多克隆抗體、ICAM-1多克隆抗體等,購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、HX-300動(dòng)物人工呼吸機(jī)和BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) (成都泰盟科技有限公司)。

4.方法

4.1 大鼠 MIRI模型制作 Wistar大鼠用20%烏拉坦 (1g/kg,ip)麻醉,用BL-420 E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切口,氣管插管,接人工呼吸機(jī)。于胸骨左側(cè)2mm第四肋間開(kāi)胸,開(kāi)胸前打開(kāi)人工呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸,頻率為60次/min,呼吸比率為3:1,通氣量20ml/kg。剪開(kāi)心包膜,輕壓胸廓,擠出心臟,在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間的左冠狀動(dòng)脈起始下方2-3mm處,用5/0醫(yī)用無(wú)損傷縫合針于左心耳下方進(jìn)針,將1號(hào)絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈前降支下,將心臟復(fù)位,然后將絲線穿于自制的尖端球形冠脈阻斷塑料管。穩(wěn)定10min后,股靜脈給藥。除假手術(shù)組絲線空置,不拉緊絲線外,其他組給藥后10min拉緊絲線,以塑料管球端壓迫結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30min后,放松結(jié)扎線,再灌注2h,并同步監(jiān)測(cè)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。實(shí)驗(yàn)中以左心室前壁紫紺及同步心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志,以左心室前壁由紫紺逐漸紅潤(rùn)及ST段降低1/2為再灌注的標(biāo)志[2]。

4.2 動(dòng)物分組及給藥 Wistar大鼠隨機(jī)分為6組,每組 10只,股靜脈給藥。①假手術(shù)(Sham)組:穿線后10min股靜脈推注生理鹽水4ml/kg,持續(xù)觀察2h。②缺血再灌注 (IR)組:缺血前10 min股靜脈推注生理鹽水4ml/kg。③溶劑 (Solution,Sol)對(duì)照組:缺血前10min股靜脈推注含10%(體積分?jǐn)?shù))PEG400和10%(體積分?jǐn)?shù))無(wú)水乙醇溶液4ml/kg。④陽(yáng)性對(duì)照藥維拉帕米組 (Verapamil,Ver):Ver用生理鹽水配成0.1g/L,缺血前 10min以 4ml/kg股靜脈推注。⑤、⑥Api低、高劑量組 (用 Api2、Api4表示):缺血前10min分別以2mg/kg、4mg/kg(芹菜素劑量的確定來(lái)自預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)股靜脈給藥。

4.3 心肌蘇木素堿性品紅苦味酸 (Hematoxylin basic fuchsin picric,HBPF)染色:

各組大鼠再灌注2h后,迅速摘取心臟,取結(jié)扎部位以下左心室缺血心肌固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋切片,行 HBPF染色 (缺血缺氧心肌呈鮮紅色至深紅色,正常心肌呈黃色或黃棕色)。

4.4 心肌 NF-κB、ICAM-1的免疫組化染色

石蠟切片后采用鏈酶親和素 (SABC)免疫組化檢測(cè)心肌NF-κB和 ICAM-1的表達(dá)。胞漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞著黃色至棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),用灰度值反映免疫組化染色的深淺程度,數(shù)值越小,表示顏色越深,陽(yáng)性程度越高。在100倍光鏡下通過(guò)BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)采集免疫組化圖像,每張切片隨機(jī)采取10個(gè)不重疊視野測(cè)量灰度值。

4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多組間差異采用單因素方差分析,采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

結(jié) 果

1.H BPF染色結(jié)果

Sham組全部心肌纖維被染為黃色;IR組和Sol組大部分心肌纖維為紅色;Api2組較多心肌纖維為紅色,肌纖維呈灶狀分布、Api4組和Ver組個(gè)別心肌纖維為紅色,胞漿紅色呈點(diǎn)狀分布 (見(jiàn)圖A)。

2.心 肌組織NF-κB表達(dá)和ICAM-1的變化

在Sham組心肌組織中,黃色顆粒僅散在少量表達(dá)于心肌細(xì)胞漿內(nèi);在IR組和Sol組大量心肌細(xì)胞漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色,顏色深染,在NF-κB染色中血管內(nèi)皮細(xì)胞染色陽(yáng)性強(qiáng)度高,在ICAM-1染色中心肌細(xì)胞漿染色陽(yáng)性強(qiáng)度較血管內(nèi)皮細(xì)胞高;在NF-κB染色中Api2組有較多的心肌細(xì)胞漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色,血管內(nèi)皮細(xì)胞染色陽(yáng)性強(qiáng)度高,顏色較 IR組和Sol組淡,Api4組有一定量的心肌細(xì)胞漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色,顏色淡染,Ver組有少量被染為黃色。在ICAM-1染色中Api2組一定量心肌細(xì)胞漿被染成棕黃色,血管內(nèi)皮細(xì)胞染色較淡;Api4組和Ver組有較少量的心肌細(xì)胞漿被染成黃色,色淡,血管內(nèi)皮細(xì)胞略有染色,染色淡。各組與Sham組比較,NF-κB和 ICAM-1表達(dá)明顯增多,有顯著性差異 (P<0.05);Api2組、Api4組與IR組比較,NF-κB和 ICAM-1表達(dá)明顯減少,有顯著性差異 (P<0.05);Api2組、Api4組之間比較,NF-κB和ICAM-1表達(dá)減少具有劑量依賴性,有顯著性差異 (P<0.05)。IR組與Sol組,Api4組與Ver組,比較差異無(wú)顯著性 (P>0.05) (見(jiàn) 表1及圖B,C)。

表1 各組大鼠NF-κB和 ICAM-1免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物灰度值 (ˉx±s)Table 1 Gray value of immunoreactive products of NF-κB and ICAM-1 in each group

討 論

核因子-κB(NF-κB)是一類與多種基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的總稱。Sen R[3]最初發(fā)現(xiàn)在B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子有特異性結(jié)合位點(diǎn) (GGGGACTTTCC),后來(lái)發(fā)現(xiàn)在許多基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上都有一個(gè)或幾個(gè)κB結(jié)合位點(diǎn)。具有這些啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的基因包括 IL-1、IL-6、 TNF-α、 ICAM-1、 VCAM-1、 COX-2、NOS等。因此NF-κB在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、重要臟器缺血再灌注損傷及細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[4]。在靜息狀態(tài)時(shí),NF-κB通常與其抑制物IκB(inhibitory protein of NF-κB)直接結(jié)合形成無(wú)活性的三聚體。心肌缺血-再灌注時(shí),啟動(dòng)多種物質(zhì)的表達(dá),而這些物質(zhì)均能直接或間接造成心肌損傷;血管內(nèi)皮細(xì)胞首先受到刺激,NF-κB被激活,啟動(dòng)多種物質(zhì)的表達(dá),包括 TNF-α、ICAM-1等,在這些因子的作用下,白細(xì)胞在缺血區(qū)血管中粘附、聚集,造成血管阻塞。同時(shí),這些因子可促使白細(xì)胞穿內(nèi)皮遷移、浸潤(rùn)并損傷心肌。聚集的白細(xì)胞又進(jìn)一步釋放炎性介質(zhì)、氧自由基等加重缺血,造成血管及心肌損傷。另外,在上述過(guò)程中產(chǎn)生的因子如 TNF-α、IL-1等又是NF-κB的強(qiáng)誘導(dǎo)劑,會(huì)進(jìn)一步激活NF-κB,形成惡性循環(huán),加重缺血損傷的程度[5,6]。若調(diào)控NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,可以對(duì)心肌起到保護(hù)作用[7]。目前,許多以調(diào)控NF-κB信號(hào)途徑為目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法正在為防治缺血/再灌注損傷探索一種新途徑。

細(xì)胞間粘附分子 (ICAM-1)是免疫球蛋白超家族的成員,心肌細(xì)胞在正常情況下僅表達(dá)極少量的ICAM-1,但在某些病理因素如缺血再灌注、毒素及 TNF-α、IL-1和 IFN-γ等刺激下,其表達(dá)明顯升高[8]。越來(lái)越多的證據(jù)也提示:中性粒細(xì)胞(PMN)浸潤(rùn)為主的炎癥是造成心肌缺血再灌注損傷的重要因素之一。ICAM-1在激活PMN及促進(jìn)心肌IR的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用,是介導(dǎo)PMN粘附浸潤(rùn)的最重要因素之一。ICAM-1的高表達(dá)可刺激PMN與內(nèi)皮細(xì)胞粘附,介導(dǎo)其對(duì)心肌細(xì)胞的浸潤(rùn),引起并加劇心肌細(xì)胞的損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。缺血預(yù)適應(yīng)可抑制 ICAM-1表達(dá),抑制PMN聚集粘附,從而產(chǎn)生保護(hù)作用。缺血再灌注時(shí),白細(xì)胞穿越血管壁到達(dá)效應(yīng)組織的過(guò)程是一個(gè)非常復(fù)雜的環(huán)節(jié),其中有兩階段是由ICAM-1介導(dǎo)的,ICAM-1表達(dá)的增加,進(jìn)一步加重了炎癥反應(yīng),也參與了心肌缺血再灌注損傷。

芹菜素是黃酮類化合物,大量的基礎(chǔ)研究已證實(shí)芹菜素具有擴(kuò)張血管調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和改善血管舒縮功能等心血管藥理作用[9],其機(jī)制之一可能是芹菜素可減少某些炎性介質(zhì),抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[10]。

在本實(shí)驗(yàn)中研究了缺血30min再灌注2h時(shí)NF-κB及 ICAM-1的表達(dá),證實(shí)它們都參與了心肌IRI,芹菜素預(yù)處理后它們的表達(dá)又都隨之下調(diào),同時(shí) HBPF染色結(jié)果提示心肌缺血缺氧程度減輕,說(shuō)明抑制NF-κB的活性,降低 IRI后炎癥因子ICAM-1的表達(dá)可能是芹菜素保護(hù)心肌IRI的重要機(jī)制?？烧J(rèn)為芹菜素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌NF-κB活化的抑制是 ICAM-1表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,鈣拮抗劑維拉帕米對(duì)缺血再灌注心肌組織有較好的保護(hù)作用。芹菜素也具有鈣拮抗作用[11],因此,減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載也可能是芹菜素對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的又一機(jī)制,但還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。此外,本實(shí)驗(yàn)排除了溶劑PEG400和乙醇對(duì)低、高劑量芹菜素組的影響。因此,芹菜素作為一種高效低毒的藥物在防治MIRI方面具有很好的前景。

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