整合素β1在CD151促HUVEC遷移增殖中的機(jī)制研究

許富英 羅望翠 曾和松 劉正湘

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科 武漢 430030;1孝感市中心醫(yī)院外科 湖北 432000)

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性狹窄或閉塞,供血持續(xù)減少或終止所產(chǎn)生的心肌嚴(yán)重缺血和壞死,是一種嚴(yán)重威脅人類生命和健康的危重癥,近年來在我國逐漸增多,血運(yùn)重建治療已成為挽救缺血心肌的重要手段。CD151已證實(shí)有促進(jìn)血管形成的作用,但其作用機(jī)制尚未完全明了,PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,活化的Akt通過磷酸化作用進(jìn)一步激活或抑制其下游靶蛋白,進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移及葡萄糖代謝等作用[1-5],本文就整合素、CD151與 PI3K/Akt信號(hào)通路之間的聯(lián)系進(jìn)行探討。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)菌與質(zhì)粒 pZeoSV-CD151由美國Tennessee大學(xué)惠贈(zèng)。pAAV-CD151-HA重組質(zhì)粒及QRD由本課題組前期構(gòu)建,rAAV包裝質(zhì)粒pXX2、腺病毒輔助質(zhì)粒phelper、真核表達(dá)載體pXXUF1含綠色熒光蛋白序列 (Green fluorescent protein,GFP)由美國 Pittsburgh大學(xué)分子遺傳及生物化學(xué)系Xiao Xiao博士惠贈(zèng)。293細(xì)胞購自ATCC(美國)。工程菌株 E.coliDH5α由同濟(jì)醫(yī)院心血管研究室保存。HUVEC細(xì)胞購自武漢大學(xué)物種保存中心。

1.2 主要試劑 DNA Maker購自大連寶生物有限公司 (TaKaRa Biotechnology),胰蛋白胨和酵母提取物購自美國DIFCO公司 (DIFCO Laboratories,USA)。瓊脂糖agarose購于美 GIBCO公司。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12、DMEM、胎牛血清 (FBS)和胰蛋白酶 (Trypsin)等均購自 GIBCO公司。小提試劑盒購自武漢天源公司,蛋白質(zhì)提取試劑Trizol購自美國Life-technologies公司,抗β-action抗體、鼠抗人CD151單克隆抗體購自美國Serotec公司,整合素β1抗體、PI3K抗體、總Akt抗體、磷酸化Akt抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司,辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔IgG抗體購自Jackson公司 (Jackson Immunoresearch Lab)。Western雜交顯影用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑 (Super Signal Substrate,ECL),購自美國PIERCE公司。PVDF膜購自美國Life Science公司。

2 方法

2.1 小量提取質(zhì)粒 將重組包裝質(zhì)粒以及輔助質(zhì)粒PXX2和Phelper分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌,增菌過夜,按小提試劑盒說明提取質(zhì)粒,室溫離心去上清,依次加入 solutionⅠ/Rnase A混合液,solutionⅡ,Buffer N3,混勻,離心轉(zhuǎn)移上清于新 EP管加0.1倍體積 ETR充分混勻冰上置10min,42℃水槽孵育5min,室溫離心轉(zhuǎn)上清于新 EP管加0.5倍體積無水乙醇靜置后再將液體轉(zhuǎn)移至新的HiBind Minicolumns柱中離心,棄去收集管中液體,再分別依次加入 HB Buffer和 DNA Wash Buffer離心,棄去收集液,然后將柱子離心甩干,并置一干凈EP管中,在無菌操作臺(tái)加入80-100μl Elution-Buffer靜置2min,13000×g離心1min洗脫出DNA,分光光度計(jì)定量后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 攜帶CD151及其突變體基因的重組腺相關(guān)病毒的包裝及滴度測定 每15μl培養(yǎng)皿加入質(zhì)?？偭繛?5μg,將其與雙蒸水及2.5mol/LCacl2混勻,然后逐滴加入2×HBS,邊加邊振搖混合液,室溫下靜置5min。更換293細(xì)胞培養(yǎng)基,將磷酸鈣-DNA懸液加入其中,在35℃3%CO2培養(yǎng)24h后更換成無血清高糖DMEM培養(yǎng)基,于37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。48h后吸棄所有培養(yǎng)基加入10ml PBS緩沖液沖洗細(xì)胞,每盤洗四次,然后加入少量 PBS緩沖液,刮取盤中293細(xì)胞,將此細(xì)胞懸液在-80℃和37℃反復(fù)凍融3次后13000 g×20 min 4℃離心,上清液即為重組腺相關(guān)病毒原液。

2.3 斑點(diǎn)雜交法確定病毒滴度 病毒原液用DnaseI和Rnase于37℃孵育1h,蛋白酶 K 37℃孵育1h,酚/氯仿抽提純化后加入 NAOH/EDTA,沸水煮5min使其變性后立即至于冰上,梯度稀釋后的病毒原液經(jīng)多孔過濾加樣器聚集在尼龍膜上,將膜于80℃干烤2h,依次進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗膜、曝光和洗片后觀察結(jié)果。

2.4 HUVEC的培養(yǎng) HUVEC用含胎牛血清 (10%)、肝素鈉的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),胰酶消化后傳代,挑選生長良好的 HUVEC制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后傳至六孔板 (隨機(jī)分為四組:CD151組、QRD組、GFP組、空白對照組)待細(xì)胞長至60%融合時(shí)每孔更換1ml新鮮培養(yǎng)基,根據(jù)病毒滴度于上述四組中按500pfu/個(gè)細(xì)胞分別加入 rAAV-CD151、rAAV-QRD、rAAV-GFP和等體積PBS,96h后收集細(xì)胞,Bradford方法測定裂解液中蛋白的濃度,然后每組取約20μg蛋白質(zhì)進(jìn)行western印跡分析,然后用化學(xué)發(fā)光試劑ECL按試劑說明書要求顯影、曝光并用凝膠分析系統(tǒng)灰度掃描來定量檢測蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

2.5 SRB法檢測細(xì)胞的增殖能力 將上述轉(zhuǎn)染了 rAAV-CD151、rAAV-QRD、rAAV-GFP和等體積PBS的細(xì)胞消化后移至96孔板依次分為四組,第一排為空白對照組不加任何液體。接種密度為5×104cell/100μl/孔,每組細(xì)胞設(shè)置 12個(gè)復(fù)孔,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h后用三氯醋酸固定,三氯醋酸的終濃度為10%,4℃靜置1h后,倒掉固定液,去離子水洗5遍,甩干,空氣干燥。SRB用1%的醋酸配成0.4%的溶液,每孔加100μl室溫靜置10min.未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸液洗5遍,空氣干燥。結(jié)合的SRB用150μl 10mmol/l非緩沖 Tris堿液溶解,Biorad酶標(biāo)儀上測定各孔在490nm的光吸收值。

2.6 劃痕試驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移 分組同上,取各組處于對數(shù)生長期的1ⅹ106的細(xì)胞接種于六孔板中,置37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育,在單層細(xì)胞表面用10μl槍頭垂直劃過并制造多條相互平行的劃痕,力度以刮落細(xì)胞而不在培養(yǎng)板上留痕為準(zhǔn),PBS清洗3次后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),記0、6h、12h、24h,4×倒置顯微鏡下觀察劃痕中細(xì)胞遷移情況并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (ˉx±s),采用 SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,P﹤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. β1、PI3K、P-Akt及 CD151蛋白表達(dá)結(jié)果分析 以β-actin為內(nèi)參,以 Control組表達(dá)為100%,CD151蛋白表達(dá)量在CD151組為 (268±2.5)%,QRD組為 (253±14.7)%,GFP組為(104±9.2)%,CD151組與 GFP組和 Control組相比CD151的表達(dá)明顯增加 (P<0.05),QRD組與 GFP組和Control組相比CD151的表達(dá)明顯增加 (P<0.05),而CD151組與QRD組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05),說明轉(zhuǎn)染CD151及其突變體能有效地感染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,并明顯地促進(jìn)該細(xì)胞CD151蛋白表達(dá)。蛋白灰度測定結(jié)果顯示CD151組與 GFP組和Control組比較β1、PI3K及P-Akt蛋白表達(dá)量均有顯著增加 (P<0.05),而Control組、GFP組和QRD組三組間比較無顯著差異 (P>0.05),QRD組與 CD151組相比β1、PI3K及P-Akt蛋白表達(dá)量明顯減少 (P<0.05),而總Akt各組之間無顯著性差異 (P>0.05)。

表1 Western blot分析各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后β1、PI3K和 P-Akt表達(dá)Table 1 The expression analysis ofβ1、PI3K and P-Akt after transfected virus in each group

2細(xì)胞增殖能力結(jié)果分析 CD151組 (0.819±0.045)與對照組 (0.530±0.046)和 GFP組(0.575±0.042)相比細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng),有顯著性差異 (P<0.05),QRD組 (0.510±0.046)與GFP組和對照組相比無顯著性差異 (P>0.05),GFP組與對照組比較無顯著性差異 (P>0.05),CD151組與QRD組相比有明顯差異 (P<0.05),細(xì)胞增殖能力明顯增加。說明CD151組有明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力,而QRD組與CD151組相比增殖能力顯著降低。

3.劃痕試驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力 24h顯微鏡下觀察結(jié)果并通過公式初始寬度-終末寬度/初始寬度計(jì)算得知 CD151組細(xì)胞遷移率為 (93±2.65)%,而QRD組細(xì)胞遷移率為 (57±3.6)%,GFP組和 Control組分別為 (60±2)%和 (54±1)%,CD151組與QRD組、GFP組和Control組相比有顯著性差異 (P<0.05),QRD組與 GFP組和Control組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明CD151組促進(jìn)細(xì)胞遷移能力比QRD增強(qiáng)。

圖5 Control組、CD151組、QRD組及 GFP組細(xì)胞遷移率直方圖分析Fig.5 The histogram analysis of cell migration rate of Control,CD151,QRD and GFP group

討 論

血管形成是在原有血管基礎(chǔ)上形成新的血管,對機(jī)體許多生理及病理情況都有很重要的作用[6-7]。CD151是一種四跨膜蛋白,它能和多種整合素相結(jié)合形成復(fù)合體,介導(dǎo)整合素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),它在細(xì)胞遷移、增殖以及體外血管的形成起著很重要的作用。在正常機(jī)體CD151缺陷或敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其并不影響正常的生理過程,而當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病理情況時(shí)CD151在血管形成時(shí)起著非常重要的作用,特別是它在病理過程中能夠?qū)ρ苓x擇性作用,明顯改善機(jī)體的狀況,減少病理情況對機(jī)體的損害,成為今后治療疾病的靶點(diǎn)[8-10]。刺激缺血區(qū)小血管生長,促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)的形成,完成缺血區(qū)血管的自我搭橋現(xiàn)已被譽(yù)為分子搭橋術(shù)或基因搭橋術(shù)[11]。心肌缺血特別是慢性缺血,血管生成及側(cè)枝循環(huán)的形成對廣泛彌漫性冠狀動(dòng)脈病變患者保護(hù)心臟功能,改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后起著很關(guān)鍵的作用。王麗等[12]研究已證實(shí)在心肌梗死大鼠轉(zhuǎn)染CD151基因后心肌微血管較正常心臟有所增多,而且左室各項(xiàng)功能參數(shù)也比對照組明顯增加,可明顯產(chǎn)生促血管新生效應(yīng),進(jìn)一步改善心肌供血和心臟功能,從而起到保護(hù)心臟的作用。但整合素及CD151通過何種機(jī)制起到這一作用眾說不一,Liu L等[13]研究在基于CD151存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)囊泡的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)CD151與其相連的整合素α3β1,α6β1及α5β1共同經(jīng)歷細(xì)胞的內(nèi)吞作用并在細(xì)胞內(nèi)小囊泡間隔聚集,并通過改變CD151的構(gòu)象研究進(jìn)一步證實(shí)CD151促進(jìn)細(xì)胞遷移是通過改變其與整合素共同的囊泡小室而進(jìn)一步改變其內(nèi)吞通路所產(chǎn)生的。Baldwin G等[14]研究下調(diào)不同類上皮細(xì)胞系 (MDA-MB-231和 Hela細(xì)胞系)的 CD151的表達(dá)可以改變?chǔ)?β1的糖基化,而改變與CD151相關(guān)的其他跨膜蛋白如CD63和CD82卻不影響α3β1的糖基化,而且證實(shí)在調(diào)節(jié)α3β1的糖基化及前向遷移能力的過程起著很重要的作用,推測其可能是通過多重并相互獨(dú)立的機(jī)制產(chǎn)生的,其中最重要的可能是通過CD151招募α3β1到跨膜蛋白富集區(qū)域,而且這要求CD151能和整合素及其他跨膜蛋白相互作用并相互影響,任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會(huì)影響其招募α3β1的聚集,進(jìn)而影響其糖基化。Zhang XA等[15]研究還發(fā)現(xiàn)跨膜蛋白在整合素和PKC的相互作用過程中起著很重要的連接作用,而且可能通過整合素-跨膜蛋白-PKC這個(gè)復(fù)合體進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移。Armulik A等[16]通過β1缺陷 GD25細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)突變體能減少細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移并減少動(dòng)脈硬化的磷酸化及PI3K、A KT的表達(dá),進(jìn)一步推測這種不顯著的PI3K依賴性信號(hào)通路是由整合素β1激發(fā)的。本研究通過轉(zhuǎn)染CD151及其突變體于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)CD151組與QRD組相比β1、PI3K、P-Akt蛋白表達(dá)量明顯增加,且細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞遷移能力也明顯增強(qiáng),而總Akt和CD151蛋白表達(dá)量卻沒有差別,我們認(rèn)為轉(zhuǎn)染CD151基因及其突變后都能有效的感染 HUVEC并明顯促進(jìn)CD151蛋白表達(dá),但因?yàn)镼RD組改變了CD151與整合素β1的正常結(jié)合,改變了整合素與下游蛋白的相互作用,明顯降低了其生物學(xué)效應(yīng)。通過本研究我們進(jìn)一步認(rèn)為CD151促進(jìn) HUVEC遷移增殖是通過整合素β1上調(diào)PI3K的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)Akt的磷酸化,增加Akt的活力,達(dá)到促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖及管狀結(jié)構(gòu)的形成,進(jìn)而促進(jìn)血管的形成。

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