上皮性卵巢癌組織中P-A KT、P-gp的表達(dá)及其臨床病理意義

蔡曉立 王澤華

(隨州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖北 441300 1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430022)

磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B,或稱 P-A KT)是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶激酶,處于 PI3K∕ P-A KT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心部位,具有絲∕蘇氨酸激酶活性。P-A KT通過磷酸化 mTOR、P21、GSK3、TSC2等多種作用底物,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。最近研究表明,多藥耐藥基因 (MDR1)是缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)作用的靶基因,而P-A KT能上調(diào) HIF-1的表達(dá)。MDR1所編碼的 P-glycoprotein(P-gp)為172KD的跨膜蛋白,可受缺氧誘導(dǎo),同腫瘤的侵襲性和對化療抵抗相關(guān)[1]。由此可見,P-A KT、P-gp與卵巢癌的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測P-A KT、P-gp在上皮性卵巢癌中的表達(dá),并探討P-A KT、P-gp在卵巢癌發(fā)展過程中的作用、對預(yù)后的影響及其之間相互關(guān)系。

材料和方法

1.研 究對象

1.1 標(biāo)本來源:選擇我院2002年10月至2003年10月手術(shù)切除的上皮性卵巢癌標(biāo)本60例,國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟 (FIGO)分期Ⅰ-Ⅱ期17例,Ⅲ-Ⅳ期43例。另取同期卵巢良性上皮性腫瘤標(biāo)本30例和30例正常卵巢組織標(biāo)本作對照。所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片備用。

1.2.主要試劑:兔抗人 P-A KT多克隆抗體,P-gp鼠抗人單克隆抗體,以及即用型免疫組化SP法廣譜試劑盒均購自武漢晶美生物工程有限公司。

2.方 法

2.1.免疫組化 SP法測定 P-A KT和 P-gp的表達(dá):對正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤和上皮性卵巢癌中的P-A KT、P-gp蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測,試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。P-A KT和P-gp的工作液濃度分別為1:50、1:40,以已知陽性反應(yīng)片作陽性對照,設(shè)PBS代替一抗作為陰性對照。

2.2.結(jié)果判定:48h內(nèi)光鏡下閱片,高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比,取算術(shù)平均值。組織切片中顯色強(qiáng)度與背景無明顯差別為陰性。P-A KT陽性細(xì)胞為細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)均勻的棕黃色顆粒,以胞漿為主,部分胞核表達(dá)。P-gp陽性細(xì)胞主要著色部位在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì),呈現(xiàn)均勻棕黃色。

3.隨 診

全部患者進(jìn)行定期隨訪,隨訪截止日期2007年4月。隨訪時間42個月至54個月。上皮性卵巢癌 (EOC)復(fù)發(fā)指經(jīng)過系統(tǒng)的首次治療后臨床病灶消失,并緩解期至少6個月,再次發(fā)現(xiàn)盆腔或腹腔病灶。生存時間為復(fù)發(fā)后治療開始至死亡或終檢之間的時間。

4.統(tǒng) 計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Spearman秩相關(guān)分析,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.P -A KT、P-gp在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)

P-A KT蛋白的陽性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿。P-gp蛋白的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞胞膜及部分胞漿。在60例上皮性卵巢癌組織中,P-A KT、P-gp蛋白的陽性表達(dá)率分別為61.7%、50.0%,均顯著高于其在正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織中的陽性表達(dá)率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見圖1,表1。

圖1 .A.P-AKT在正常卵巢中的陰性表達(dá);B.P-AKT在卵巢良性腫瘤中的陽性表達(dá);C.P-gp在卵巢良性腫瘤中的陽性表達(dá);D.P-AKT在上皮性卵巢癌中的陽性表達(dá);E.P-gp在上皮性卵巢癌中的陽性表達(dá) (A-E,SP法×400)Fig 1.A.negative expression of P-AKT in normal ovarian;B.positive expression of P-AKT in benign epithelial ovarian tumor;C.positive expression of P-gp in benign epithelial ovarian tumor;D.positive expression of P-AKT in EOC;E.positive expression of P-gp in EOC(A-E,SP method×400)

表1 P-A KT、P-gp在正常卵巢、卵巢良性腫瘤和上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)Table 1 The expressions of P-A KT、P-gp in tissues of normal ovarian,benign epithelial ovarian tumors as well as epithelial ovarian cancer

表2 P-A KT、P-gp的表達(dá)及與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系T able 2 The relationship between P-AKT,P-gp protein expression and clinicopathological factors of epithelial ovarian cancer

2.P -A KT、P-gp蛋白陽性表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

P-A KT、P-gp蛋白在Ⅲ、Ⅳ期中的陽性率較Ⅰ、Ⅱ期高,陽性組的復(fù)發(fā)率較陰性組高,差異具有顯著性 (P<0.05),見表2。

3.P -A KT和P-gp蛋白在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

在60例上皮性卵巢癌組織中,兩者均陽性表達(dá)者為26例,均陰性表達(dá)者為19例,兩者的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性 (r=0.26,P<0.05.),見表3。

表3 在上皮性卵巢癌組織中P-A KT與P-gp的表達(dá)相關(guān)性Table 3 The relationship between the expression of P-A KT and P-gp protein in epithelial ovarian cancer

4.P -A KT和P-gp蛋白的表達(dá)與患者生存情況的關(guān)系

在60例上皮性卵巢癌患者的隨訪中,PA KT、P-gp陽性組的生存率 (分別為 62.2%、56.7%)顯著低于其各自陰性組的生存率 (分別為91.3%、90.0%),見圖2,3。

圖2 P-AKT(+)和P-AKT(-)患者的生存率Fig.2 The survival rate of patients with positive and the negative expression of P-AKT

討 論

1.P -gp與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

P-pg是分子量為172KD的細(xì)胞膜糖蛋白,是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一。P-gp在腫瘤細(xì)胞的胞膜上過度表達(dá),利用ATP水解釋放的能量將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外,降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度,從而產(chǎn)生耐藥性[2]。在導(dǎo)致多藥耐藥的各種機(jī)制中,MDR-1基因編碼的P-gp蛋白途徑是主要的機(jī)制[3]。有資料顯示表達(dá)MDR/P-gp的卵巢癌隨著病情進(jìn)展,對MDR相關(guān)化學(xué)藥物反應(yīng)性差[4],與卵巢癌的復(fù)發(fā)、預(yù)后也存在一定關(guān)系。

圖3 P-gp(+)和P-gp(-)患者的生存率Fig.3 The survival rate of patients in the positive and the negative expression of P-gp

研究顯示正常的卵巢組織及卵巢良性腫瘤中幾乎檢測不到P-gp表達(dá),而卵巢癌組織中P-gp表達(dá)陽性率增大 (為50.0%),與 Krasznai等[5]報(bào)道的結(jié)果相近,這說明P-gp可能是卵巢惡性腫瘤所固有的表達(dá),可能由于癌基因和抑癌基因的改變使MDR1基因活化[6]。Ⅲ、Ⅳ期患者的 P-gp陽性率比Ⅰ、Ⅱ期的明顯增高,進(jìn)一步提示 P-gp表達(dá)的上調(diào)可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。P-gp陽性表達(dá)可能通過分泌細(xì)胞因子、生長因子或其他影響腫瘤組織連接的因子,影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究顯示P-gp陽性組復(fù)發(fā)率高于陰性組,生存率明顯低于陰性組,提示P-gp表達(dá)增加可能使細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度下降從而產(chǎn)生耐藥,降低了對癌細(xì)胞增長和浸潤的抑制,表明P-gp可能是較為有用的判斷預(yù)后的指標(biāo)。

2.P -A KT與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

A KT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,只有磷酸化的A KT(P-A KT)才具有生物學(xué)活性,因其蛋白產(chǎn)物與蛋白激酶A及蛋白激酶C具有高度同源性,又命名為蛋白激酶B(PKB)[8],是一種癌基因。P-A KT通過作用于各種下游分子,調(diào)控細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞增值,抑制細(xì)胞凋亡,從而影響著腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展[9]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[10]將具有持續(xù)活性的myr-P-A KT1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入NH3T3細(xì)胞中,導(dǎo)致了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,表明P-A KT的異?；罨瘜δ[瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中P-A KT的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織,提示P-A KT異常是上皮性卵巢癌的多發(fā)事件[11]。隨著FIGO分期的進(jìn)展,P-A KT蛋白陽性表達(dá)明顯增高,表明A KT激酶活性增高與惡性或更高分期的腫瘤有關(guān),說明P-A KT在卵巢癌的發(fā)展過程中起著重要作用。P-A KT陽性組的表達(dá)在復(fù)發(fā)率和生存狀況中都與陰性組有很大差異,說明P-A KT的過度活化,能促使卵巢癌細(xì)胞黏附運(yùn)動增強(qiáng),侵襲力增加[8],可能會使惡性腫瘤易于轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā),并導(dǎo)致生存率下降。

3.上皮性卵巢癌中P-AKT與P-gp的相互關(guān)系

P-A KT通過磷酸化 mTOR、P21、GSK3、TSC2等多種作用底物,并可能上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖,抑制細(xì)胞凋亡[12],促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)血管生長,抵抗化療和放療中細(xì)胞的凋亡,提示P-A KT活化可能是腫瘤多藥耐藥的產(chǎn)生機(jī)制之一。最近研究表明,多藥耐受基因 (MDR1)可能也是 HIF-1作用的靶基因,它所編碼的P-gp糖蛋白可受缺氧誘導(dǎo),同腫瘤的侵襲性和對化療抵抗相關(guān),提示P-A KT可能誘導(dǎo)MDR1所編碼的P-gp糖蛋白的表達(dá)上調(diào)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 P-A KT陽性表達(dá)與 P-gp陽性表達(dá)呈正相關(guān) (r=0.26,P<0.05),即P-A KT活化的腫瘤組織中存在著P-gp的高水平表達(dá),證明P-A KT不僅通過抑制細(xì)胞凋亡來提高腫瘤生存能力,還可以調(diào)控多藥耐藥相關(guān)的各種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接誘導(dǎo)多藥耐藥[13]。P-gp的表達(dá)可能受活化P-A KT的調(diào)節(jié),P-A KT的異常激活可能促進(jìn)P-gp的過表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低引起耐藥,使藥物抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力降低,細(xì)胞發(fā)生癌變能力增強(qiáng),說明兩者有一定的協(xié)同作用,可能共同促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展并導(dǎo)致遠(yuǎn)期生存率低。

總之,P-A KT和P-gp在上皮性卵巢癌組織中存在異常的胞漿和/或胞膜表達(dá),異常表達(dá)的 PA KT和P-gp與卵巢癌的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其對預(yù)后結(jié)果的影響可作為提高治療效果以及減少腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)研究的理論基礎(chǔ)。

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