RNA 干擾PLCε誘導人膀胱癌BIU-87細胞凋亡的實驗研究

趙 懿 羅春麗 郭永燦 歐俐蘋

(重慶醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗系,臨床檢驗診斷學省部共建教育部重點實驗室,重慶市重點實驗室,重慶400016)

Ras是最早發(fā)現與膀胱癌相關的癌基因[1],而PLCε是一種新的人源性磷脂酰肌醇磷脂酶C(PIPLC)[2],為Ras信號通路的下游分子,能與富含GTP的Ras家族成員以Ras-受體相互作用合而被激活[3]。本研究利用針對 PLCε的shRNA重組質粒轉染膀胱癌細胞株BIU-87阻斷 PLCε基因表達后[4],觀察其對膀胱癌細胞凋亡的影響。

材料和方法

1.材料 人膀胱癌細胞株BIU-87(由重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲研究所惠贈),PLCε shRNA陽性質粒P和陰性質粒NP由本課題組自行構建,Lipofectamine 2000(Invitrogen公司),PCR引物合成 (大連寶生物公司),PVDF膜 (北京鼎國公司),羊抗人 PLCε多克隆抗體 (Santa Cruz公司),流式細胞儀 (美國 FACS-440型),數字化凝膠成像分析儀 (美國Bio-Rad公司)。

2.實驗分組 對照組:空白對照組 (只加脂質體)、陰性重組質粒 (轉染NP);實驗組:陽性重組質粒 (轉染 P)。

3.細胞培養(yǎng)及轉染 膀胱癌細胞株BIU-87用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,待細胞長滿80%-90%時,用脂質體介導重組質粒P和NP進行轉染,脂質體與質粒的用量比為 20μl:8μg,轉染步驟按 Lipofectamine2000轉染說明書操作。

4.RT-PCR檢測 PLCεmRNA表達 轉染48h后,向各瓶細胞中加入1ml TRIzol待細胞充分裂解后,按總RNA提取操作步驟抽提細胞總RNA,同時提取未轉染BIU-87細胞的總RNA作為空白對照。以提取的總 RNA作模板進行 RTPCR反應。引物通過 Primer5.0軟件設計,PLCε引物:正義鏈5’-CATGGAAGGATAA GCGTTGGT-3’,反義鏈 5’-CCCAA G TCCCGTGTTAAGA-3’,產物長度為395bp;內參 (β-actin)引物:正義鏈5’-AAGTGCTCC GTGTGGATCGG-3’, 反 義 鏈 5’-TCAAGTTGGGGGACAAAAAG-3’,產物長度為543bp。反應參數為94℃預變性 2min,94℃30s,56℃30s,72℃30s,35個循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸5min。取PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀分析,用Quantity One圖像分析軟件測定灰度值,以PLCε/β-actin表達水平行半定量分析,并計算與空白對照的比值 (%)。

5.Western blot檢測 PLCε蛋白表達 收集各組BIU-87細胞,按1×107細胞濃度加入100μl細胞裂解液冰上放置30min,4℃12000rpm離心15min,取上清液加上樣緩沖液 100℃煮沸變性5min,為確保蛋白上樣量一致,樣品中蛋白經Bradford定量,通過8%SDS-PAGE分離后轉至PVDF膜上。加入羊抗人 PLCε抗體 (1:200)4℃過夜,用 TBST洗膜3次;辣根標記兔抗山羊IgG二抗 (1:5000)37℃溫育 2h,TBST洗滌PVDF膜3次后進行化學發(fā)光反應。將A、B兩種顯色底物1:1等體積混和,將混合物覆蓋在膜表面,避光反應2min,搖晃使均勻,在BIO-RAD凝膠成像儀上圖像分析。

6.FCM檢測細胞周期及凋亡 檢測細胞周期:將各組BIU-87細胞制成單細胞懸液,用PBS洗滌兩次后轉入1ml預冷70%乙醇溶液中固定18-24h后與等體積的 PI染液混合,4℃放置 20-30min;測定前將樣品用300目的尼龍膜過濾后加入FCM的樣品室,以激發(fā)波長488nm測定。檢測細胞凋亡:收集各組BIU-87細胞1-5×105個,以含10%FCS的1640培養(yǎng)液洗滌2次后用孵育緩沖液5min洗滌1次,用1μg/ml的標記液100μl重懸細胞,室溫下避光孵育10-15min;500-1000rpm離心5min沉淀細胞,孵育緩沖液洗1次;加入1μg/ml的AnnexinV和7-AAD熒光溶液各5μl,4℃下孵育20min并避光。激發(fā)光波長用488nm,用一波長為570nm的通道濾器檢測PE熒光,另一波長大于670nm的濾器檢測7-AAD。

7.細胞超微結構觀察 收集各組細胞大于1×106個,分別移入四只 EP管中,4℃2000rpm離心20min后棄去上清液,加入4%戊二醛4℃固定2h,0.1MPBS(p H7.2)沖洗,1%鋨酸再固定1h后,丙酮梯度脫水,618環(huán)氧樹脂包埋,半薄切片,光鏡定位,超半薄切片做成鉛銅網,經醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色后,用日本 Hitachi-600透射電鏡觀察及照相。

8.統(tǒng)計學處理 結果以 ˉx±s表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理,采用方差分析、SNK法和t檢驗,以 P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.RT-PCR檢測轉染前后 PLCεmRNA表達結果表明: (見圖1、表1)P轉染成功后細胞PLCεmRNA表達明顯較轉染NP和空白對照組減弱,抑制率為78.7%,而β-actin表達量在各組之間無顯著差異,證明轉染p Genesil-PLCε重組質粒對PLCεmRNA的表達抑制是特異的。

圖1 RT-PCR分析各組細胞PLCεmRNA表達1空白對照組;2.陰性質粒組;3.P質粒組;4.DNA marker(100bp)Fig.1 The PLCεmRNA expression in the cells of different group by RT-PCR analysis1.Control group;2.Negative plasmid group;3.P Plasmid group;4.DNA marker(100bp)

圖2 .Western blot檢測各組細胞PLCε蛋白表達1.空白對照組;2.P質粒組;3.陰性質粒組;Fig.2 The PLCεprotein expression in cells of different group by Western blot

2.Western blot結果 結果見圖2。Bio-RAD圖像分析結果:P轉染組的積分光密度值明顯低于其他兩組 (表2),P轉染組細胞的PLCε蛋白表達受到明顯抑制,抑制率是76.6%,差異有顯著統(tǒng)計學意義;而NP質粒轉染組與空白對照組之間的差異無顯著統(tǒng)計學意義。證明轉染p Genesil-PLCε重組質粒對PLCε蛋白表達的抑制是特異的。

表1 實驗組與對照組PLCεmRNA OD值Table 1 The OD values of PLCεmRNA in experimental and control group

表2 實驗組與對照組Western blot條帶IOD值變化Table 2 The IOD values of western blot band in experimental and control group

3.流式細胞術檢測細胞周期及凋亡 PI單染法檢測細胞周期:結果見表3:實驗組 G0/G1期細胞比例顯著增加,S期和G2/M期細胞比例顯著減少,呈明顯 G0/G1期阻滯現象且出現了明顯的凋亡峰 (sub-G1峰)。證明轉染 P質粒能將BIU-87細胞阻滯于 G0/G1期,使進入分裂期 (S期)的細胞數量顯著減少,從而促進癌細胞凋亡。

表3 轉染重組質粒后BIU-87各組細胞周期分布變化Table 3 The cell cyele changes in Biu-87 cells of different group after plasmid transfection

PE-AnnexinV/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡:結果見圖3。BIU-87對照組細胞的凋亡率 (圖右下角)為2.77±0.04%,實驗組細胞的凋亡率為16.84±2.11%呈顯著增高 (P<0.05)。實驗表明轉染P質粒能誘導BIU-87細胞凋亡。

圖3 轉染P質粒對細胞凋亡的影響Fig.3 The effect of P plasmid trasfection on cell apoplosis

4.細胞超微結構觀察 對照組細胞形狀不規(guī)則,大小不一,有多個核仁呈核分裂象,核漿比例增大 (圖4A);處理組可見細胞染色質凝固、細胞核碎裂,產生凋亡小體 (圖4B)。

圖4 A對照組 (×7000) 圖4B實驗組細胞中凋亡小體 (×12000)Fig.4A Control group Fig.4B Experimental group

討 論

膀胱癌相關基因中,Ras基因最為常見,參與細胞增殖信號傳導,編碼鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)[5,6]。Ras激活后,G蛋白只保留 GTP結合活性而無水解活性,故持續(xù)激活,有絲分裂信號持續(xù)傳入,細胞過度增殖[7]。在Ras信號通路眾多下游效應蛋白中,近年來磷脂酶C(phospholipase C,PLC)家族中一個新的亞型 PLCε被發(fā)現,除與其他PLC同有典型結構域X、Y和C2,其羧基端還具有特異性的 Ras結合 (ras association,RA)結構域和氨基端鳥苷酸交換因子 (guanine nucleotide exchange factor,GEF)結構域[8,9]。各結構域的功能如下:催化結構域X和 Y能夠催化 PIP2(磷脂酰肌醇-4,5二磷酸)水解為 IP3(三磷酸肌醇)和DAG(二脂酰甘油);調節(jié)結構域C2能接受 G蛋白調節(jié);RA結構域能與富含GTP的 ras家族成員 (如 Ras,Rho,and Gα,β,γ等)以Ras-受體相互作用的方式結合,從而激活PLCε;RasGEF結構域能夠作為 Ras的調節(jié)因子與Ras結合,促進 ras-GTP的形成,從而激活Ras[10]。此 G蛋白效應酶能被上游的Ras、Rho家族和G蛋白雙向調節(jié),參與水解磷脂酰肌醇,還可激活Ras/MAPK途徑[11,12]。Bai[13]等認為在化學致癌物誘導皮膚癌過程中PLCε起非常重要的作用,并與腫瘤增殖有關,但PLCε對膀胱癌細胞的作用未見報道。本研究成功構建了針對 PLCε的shRNA抑制其表達,檢測PLCε基因沉默對膀胱癌細胞凋亡的影響,為治療膀胱癌提供新的分子靶點。

細胞周期是指一個細胞經生長、分裂而增殖成兩個細胞的全過程,包括兩個時期:細胞分裂期(M期)和分裂間期,分裂間期又包括 G0期 (休眠期)、G1期 (DNA合成前期)、S期 (DNA合成期)和 G2期 (DNA合成后期)。有研究認為腫瘤是一類細胞周期性疾病,細胞生長周期的失調在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[14],因而異常細胞周期是解釋癌變的中心環(huán)節(jié),也是分析轉染 PLCε shRNA促進細胞凋亡機制的出發(fā)點。我們對轉染P質粒的細胞周期的結果分析顯示,G0/G1期細胞比例顯著增加,S期和 G2/M期細胞比例顯著減少,呈明顯 G0/G1期阻滯并出現亞二倍體“凋亡峰”(且電鏡觀察到凋亡小體),使得DNA合成期的BIU-87細胞減少從而抑制了腫瘤細胞的增殖,促進細胞凋亡。已知多數腫瘤化療藥物均是通過抑制細胞周期達到抗瘤目的,我們的研究顯示轉染P質粒同樣具有細胞周期抑制劑的作用,為其成為腫瘤基因治療手段的可能性提供了理論依據。

PLCε基因是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關的一種基因,將其shRNA導入到該基因表達高的膀胱癌細胞系中,可誘導腫瘤細胞凋亡。這一發(fā)現為腫瘤的基因治療提供了新的思路和理論依據。然而對于PLCε基因的研究,還有許多問題需要闡明,如PLCεsiRNA的具體作用途徑及其相互關系;腫瘤中PLCε功能失活的基礎、表達的調控等,因此PLCε的研究前景廣闊。

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