α-Actinin影響丙型肝炎病毒非結構蛋白與脂筏的關聯(lián)及復制

宋武慧，潘婷婷，袁正宏

復旦大學上海醫(yī)學院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室, 上海200032

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染人體后可在細胞內(nèi)持續(xù)復制，導致慢性肝炎、肝硬化， 最終可能發(fā)展成肝細胞肝癌而引起患者死亡[1]。目前認為，HCV編碼的多聚蛋白可被切割成病毒的結構蛋白和非結構蛋白(nonstructural protein，NS)，其中非結構蛋白在病毒復制中起關鍵作用[2]。首先HCV NS4B可引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER) 膜結構變化，形成可耐受核酸酶及蛋白酶的泡膜結構；然后HCV非結構蛋白與宿主蛋白相互作用在此結構上形成復制復合體(replication complex，RC)，為HCV復制提供場所[3]。有研究報道，HCV復制復合體中非結構蛋白可與脂筏標志分子共定位于去污劑耐受膜(detergent-resistant membrane，DRM)，表明脂筏與HCV復制密切相關[4]。本實驗室曾利用蛋白質(zhì)組學結合生物學分析，分離鑒定含有HCV復制復合體的脂筏成分，發(fā)現(xiàn)復制復合體對脂筏刪除試劑敏感，該試劑可使NS5A與復制復合體的重要成分VAP-33共定位消失，證實HCV復制復合體與脂筏相關，且NS5A為HCV 復制復合體完整性的重要標志分子[5-7]。

α-actinin廣泛存在于肌型和非肌型細胞中，可結合并交聯(lián)F-肌動蛋白(actin)，其中肌型α-actinin可參與肌肉的收縮調(diào)節(jié)；非肌型α-actinin可參與集結肌動蛋白微絲，形成張力纖維(stress fibre)，并將其錨定于細胞膜，是細胞微絲骨架與細胞膜相互作用的重要橋梁，在維持細胞正常形態(tài)中起重要作用[8]。已有研究表明，α-actinin第12位為酪氨酸磷酸化位點，當加入局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)使第12位磷酸化后，原與肌動蛋白緊密交聯(lián)的α-actinin隨即解離。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)和鈣離子可結合α-actinin，使其與肌動蛋白的結合力下降，導致細胞骨架蛋白流動，有利于細胞運動和遷移[9]。此外α-actinin還可與細胞膜黏附分子、細胞膜受體等相互作用，參與細胞黏附、轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)化、膜受體表達等多種生理過程[10]。

本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，α-actinin參與調(diào)控HCV亞基因組RNA合成[11]，但其參與病毒復制的具體機制尚不清楚。為深入研究α-actinin參與HCV復制的分子機制，本課題分別在復制子系統(tǒng)和感染性病毒顆粒HCVcc系統(tǒng)中證實α-actinin參與HCV復制，隨后的膜漂浮實驗顯示α-actinin可與HCV NS5A共定位于脂筏。利用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術抑制內(nèi)源性α-actinin表達，NS5A從脂筏脫落。免疫熒光結果顯示，NS5A與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志分子calnexin核周共定位消失。以上研究初步探討了α-actinin參與HCV復制的機制，為深入闡明HCV復制機制打下了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料包括Huh7.5細胞(美國Rockefeller大學Charles Rice教授惠贈)，復制子細胞(本室構建保存)；DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，DMSO(Merck公司)，青霉素(1×105u/L)、鏈霉素(0.1 g/L) (Gibco公司)，細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板(NUNC公司) ；限制性內(nèi)切酶(NEB公司、MBI公司)， TRIzol、TRIzol LS、DEPC、Opti-MEM(Invitrogen公司)，Tris飽和酚、氯仿(上海申能博彩公司)，ExTaqHS酶(TaKaRa公司) ，SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司) ，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Promega公司)；轉(zhuǎn)染試劑：FuGene 6(Roche公司)，RNAiMAX(Invitrogen公司)；anti-actinin抗體(Santa Cruz公司)，anti-β-tubulin抗體、anti-actin抗體、anti-HA抗體(Sigma公司)，anti-NS3抗體、anti-NS5A(1b) 抗體(ViroGen公司)，anti-NS5A 9E10(2a)抗體(Charles Rice教授惠贈)，anti-myc抗體(Santa Cruz公司)，anti-calnexin抗體、小鼠二抗、大鼠二抗 ( Santa Cruz公司)，熒光二抗cy3、Alexa 488(Molecular Probes公司)，硝酸纖維素膜(孔徑0.22 μm，Schlercher & Schuell BioScience公司)；宿主菌Top10F(Invitrogen公司) ，質(zhì)粒抽提純化試劑盒(Qiagen公司、Macherey-Negal公司) ，ECL發(fā)光(PerkinElmer公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)Huh7.5和JFH1感染的 Huh7.5細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105u/L青霉素、0.1 g/L 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基, 置5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d 傳代1次。復制子細胞培養(yǎng)液中再加0.5 μg/ml 的殺稻瘟菌素(blasticidin)。

1.2.2質(zhì)粒構建以肝文庫cDNA為模板，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增α-actinin片段，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后分別插入2種載體后形成質(zhì)粒pCMV-HA-α-actinin和pcDNA3.1-α-actinin-myc。質(zhì)粒均經(jīng)測序驗證。

1.2.3轉(zhuǎn)染siRNA將復制子細胞接種于24孔板，用于蛋白免疫印跡和定量PCR實驗；將復制子細胞接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿，用于膜漂浮和免 疫熒光實驗。無相關RNA作為陰性對照。siRNA 序列(HSS100130)共3種，分別為5′-UUGCAUGGCAUGCAUGGUGUUCUCG-3′；5′-CGAGAACACCAUGCAUGCCAUGCAA-3′；5′-AAUAUCAUAACCCAAGCUGAUGAGG-3′。siRNA轉(zhuǎn)染采用RNAiMAX。具體方法參照說明書，轉(zhuǎn)染6 h后換成完全DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4JFH1感染細胞的建立pJFH1質(zhì)粒由日本W(wǎng)akita T教授惠贈。質(zhì)粒模板線性化后，體外轉(zhuǎn)錄JFH1 RNA并電轉(zhuǎn)染入Huh7.5細胞，定期收集病毒并檢測病毒滴度。具體方法參照文獻[12]。

1.2.5JFH1感染實驗將 Huh7.5細胞接種于12孔板，當細胞融合70%～80%時，以FuGene 6轉(zhuǎn)染pCMV-HA-α-actinin，DNA總量1 μg，以轉(zhuǎn)染pCMV-HA和未轉(zhuǎn)染細胞為陰性對照。轉(zhuǎn)染24 h 后將細胞轉(zhuǎn)移到6孔板，12 h后感染HCV(感染復數(shù)0.1)。感染后12 h用磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS) 洗3 次，更換新鮮培養(yǎng)液，48 h后收集細胞及培養(yǎng)液。

1.2.6病毒滴度測定將Huh7.5細胞接種于96孔板，過夜貼壁后加入病毒濃縮液；12 h后更換新鮮培養(yǎng)液，48 h后收集細胞；免疫熒光標記NS5A并計數(shù)陽性細胞。為保證計數(shù)準確，由2人分別各數(shù)2次，取平均值，計算病灶形成單位(focus-forming unit，F(xiàn)FU)。具體方法參照文獻[12]。

1.2.7蛋白免疫印跡法蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%牛奶(PBS配制)封閉后，分別加anti-NS3抗體、anti-NS5A 抗體、anti-actin抗體、anti-β-tubulin抗體、anti-actinin抗體、anti-myc抗體和anti-HA抗體，置4 ℃ 過夜。用PBST(含0.05% Tween-20的PBS) 洗膜3次，每次10 min，加入相應辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 標記的二抗，置室溫2 h，PBST 洗膜3 次，ECL 發(fā)光。

1.2.8熒光定量PCR用TRIzol 裂解 JFH1感染細胞，用TRIzol LS裂解細胞培養(yǎng)液。分別加入對應量氯仿，震蕩混勻，12 800g離心15 min。取上層水相，加適量異丙醇沉淀RNA，12 800g離心15 min。300 μl 70%乙醇洗滌沉淀，12 800g離心15 min。棄液體，沉淀干燥后加SuperScript Ⅱ體系，快速去除基因組DNA 并進行反轉(zhuǎn)錄。取2 μl 反轉(zhuǎn)錄cDNA與相應引物(sense: 5′-CCCTGTGA- GGAACTATCTGTCTTCACGC-3′; antisense: 5′-TCCAGAGCATCTGGCACGTA/GGTACTCG-3′)，加至實時熒光定量PCR 反應液中(總體積18 μl)。樣品95 ℃變性3 min ；先按95 ℃5 s、55 ℃10 s、72 ℃20 s 進行3個循環(huán)，接著按95 ℃15 s、60 ℃30 s、79 ℃8 s進行36個循環(huán)。在每個循環(huán)結束前系統(tǒng)自動檢測熒光產(chǎn)物的量，所有循環(huán)結束后繪制熔解曲線，判斷擴增產(chǎn)物的特異性。用ABI 7500 software進行數(shù)據(jù)處理，對兩樣本均數(shù)t檢驗,P<0.05為有顯著統(tǒng)計學差異。每組數(shù)據(jù)重復3次。

1.2.9膜漂浮實驗首先將1.5×107個復制子細胞用PBS 洗1次，在冰上刮取細胞，4 ℃，900g離心5 min。收集細胞，沉淀物用0.95 ml 預冷低滲緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8；10 mmol/L NaCl；EDTA-free protease inhibitor cocktail)懸浮，冰上放置15 min使細胞溶脹，用玻璃勻漿器抽吸20次。細胞裂解液4 ℃，900g離心5 min。棄沉淀物，上清液加入50 μl 20%的NP-40，使其終濃度為1%，冰上放置30 min?？傮w積1 ml的懸液與3 ml 72% (W/W)蔗糖溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5；25 mmol/L KCl；5 mmol/L MgCl2)混勻，其上逐步添加4 ml 55% (W/W)、1.5 ml 10% (W/W)蔗糖溶液。離心管多余部分用液狀石蠟補平，4 ℃，24 000g離心16 h。從蔗糖梯度頂端依次取1 ml，共9組，每組加4 ml 冰冷100%甲醇，混勻，10 000g離心10 min。沉淀物加50 μl 2×SDS Loading Buffer，煮沸10 min；取15 ml 進行10% SDS-PAGE分離，然后用針對α-actinin、NS5A和myc的抗體進行蛋白免疫印跡實驗，檢測蛋白條帶。

1.2.10免疫熒光實驗實驗玻片的處理：無水乙醇浸泡蓋玻片，用10 μg/ml 的poly-D-lysine 37 ℃處理過夜。細胞收集后，PBS洗1次，加入3.5%聚合甲醛，室溫固定15 min；吸去固定液，加30 mmol/L甘氨酸(PBS配制)終止反應5 min；PBS洗3次，加PBS+0.1% Triton X-100室溫穿透5 min；PBS洗2次，加3% PBS-BSA封閉1 h；加一抗NS5A和calnexin(PBS-BSA稀釋)，4 ℃過夜；PBS洗3次，每次5 min，加熒光二抗cy3和Alexa 488室溫孵育1 h；PBS洗3次，每次10 min，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(1∶5 000，用PBS稀釋)染色，Mowiol封片，共聚焦觀察(Leica，TCS-NT，Heidelberg，Germany)。

2 結果

2.1 抑制α-actinin表達導致HCV非結構蛋白減少

為抑制內(nèi)源性α-actinin表達，首先對siRNA-actinin序列進行選擇。在HCV復制子細胞中分別轉(zhuǎn)入3組siRNA-actinin，與無相關對照相比，3組α-actinin表達皆受抑制。其中轉(zhuǎn)染siRNA-actinin 2(5′-CGAGAACACCAUGCAUGCCAUGCAA-3′)后，α-actinin表達顯著減少，因此以該序列作為siRNA-actinin(圖1A)。

在HCV復制子細胞中轉(zhuǎn)入siRNA-actinin，無相關對照siRNA為陰性對照，48 h后收集細胞，用蛋白免疫印跡法檢測α-actinin及HCV非結構蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，抑制細胞內(nèi)α-actinin表達導致NS5A和NS3表達均減少(圖1B)。HCV RNA水平亦受抑制，與本室已報道的結果一致[11]。

HCV replicon cells were transfected with control siRNA or siRNA-actinin. At 48 h post-transfection, the cells were harvested. A: Immunoblotting analysis of protein expression level with antibodies against actinin. Actin was detected as a loading control. B: Immunoblotting analysis of protein expression level with antibodies against NS3 and NS5A. Tubulin was detected as a loading control.

圖1抑制α-actinin表達導致HCV非結構蛋白減少

Fig.1Knockdownofα-actinininhibitedHCVnonstructuralproteinexpressioninrepliconcells

2.2 過表達α-actinin可上調(diào)JFH1中HCV RNA水平及其非結構蛋白表達

為驗證α-actinin是否僅參與HCV1b亞型的調(diào)控，我們進一步在Huh7.5細胞中轉(zhuǎn)染 pCMV-HA-α-actinin，以轉(zhuǎn)染pCMV-HA和未轉(zhuǎn)染細胞為陰性對照。轉(zhuǎn)染24 h 后將細胞轉(zhuǎn)移到6孔板，12 h后感染HCV2a亞型病毒(感染復數(shù)0.1)，感染后12 h更換新鮮培養(yǎng)液。48 h后收集細胞和細胞培養(yǎng)液，蛋白免疫印跡和定量PCR法分別檢測α-actinin質(zhì)粒及HCV非結構蛋白的表達和HCV RNA水平；病毒滴度測定方法檢測細胞培養(yǎng)液中病毒顆粒感染性。結果顯示，Huh7.5細胞轉(zhuǎn)染pCMV-HA-α-actinin后，蛋白表達增加(圖2A)。與對照組相比，當α-actinin表達增加時，NS5A表達隨之增加，細胞內(nèi)和細胞培養(yǎng)液中HCV RNA 水平亦同時增加，約為陰性對照的2倍(P<0.05，圖2B、C)，培養(yǎng)液中HCV滴度(ffu/ml)也顯著增高，約為陰性對照的4倍(P<0.05，圖2D)。

2.3 復制子細胞中α-actinin亞細胞定位于脂筏

已知HCV非結構蛋白與宿主蛋白相互作用可在脂筏上組裝成復制復合體[4]。為探討α-actinin在HCV復制子細胞中的定位，我們分別瞬時轉(zhuǎn)染全長pcDNA3.1-α-actinin-myc和pcDNA3.1-myc，48 h后收集細胞，用不連續(xù)蔗糖密度梯度法分離細胞中的脂筏成分。結果顯示，α-actinin質(zhì)?？稍诩毎麅?nèi)表達，且與NS5A位于相同膜組分，共定位于脂筏(圖3)。免疫熒光結果也顯示，α-actinin與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志分子calnexin核周共定位(結果未展示)。

2.4 抑制α-actinin表達影響HCV非結構蛋白的膜定位

鑒于α-actinin具有骨架蛋白特性且定位于脂筏，我們推測其可能通過影響HCV非結構蛋白的亞細胞定位來調(diào)控HCV復制。為證實該假設，在HCV復制子細胞中轉(zhuǎn)入siRNA-actinin，無相關siRNA為陰性對照，48 h后收集細胞，分別用膜漂浮和免疫熒光實驗檢測HCV復制復合體重要成分之一——NS5A的細胞定位。結果顯示，陰性對照組中內(nèi)源性α-actinin與NS5A共定位于去污劑耐受膜組分，與圖3一致；而轉(zhuǎn)染siRNA-actinin組中，α-actinin細胞內(nèi)表達受抑制，同時NS5A蛋白曝光8 min，結果顯示其脂筏定位改變，原本定位于脂筏的NS5A 約50%從去污劑耐受膜組分脫落至去污劑不耐受膜組分(圖4A)；NS5A典型核周分布消失，未發(fā)現(xiàn)與calnexin共定位(圖4B)。結果提示，α-actinin的減少可影響復制復合體組成蛋白NS5A的膜定位。

Huh7.5 cells were untransfected (Mock) and transfected with pCMV-HA (Vector) or pCMV-HA-α-actinin. At 24 h post-transfection, the cells were trypsonized and transferred to 6-well plates. The virus suspension was added and the medium was switched to fresh complete DMEM at 12 h post-infection. The cells and supernatant were harvested at 48 h post-infection. A: Immunoblotting analysis of protein expression level with antibodies against NS5A and HA. Tubulin was detected as a loading control. B, C: Cells and supernatant were treated with TRIzol and TRIzol LS reagent, respectively. The real-time PCR signals were analyzed using ABI 7500 software.*P<0.05. D: Titration of infectious HCV for NS5A expression was used to quantitate the amount of HCVcc infectivity as ffu/ml.*P<0.05.

圖2過表達α-actinin可上調(diào)JFH1中HCVRNA水平及其非結構蛋白表達

Fig.2Overexpressionofα-actininupregulatedHCVRNAlevelandnonstructuralproteinexpression

HCV replicon cells were transfected with pcDNA3.1-myc or pcDNA3.1-α-actinin-myc. At 48 h post-transfection, the cells were collected for membrane flotation analysis. Immunoblotting analysis of protein expression level with antibodies against myc and NS5A.

圖3復制子細胞中α-actinin亞細胞定位于脂筏

Fig.3α-actininwaslocatedinlipidraftinrepliconcells

3 討論

本研究分別在1b型HCV復制子和2a型JFH1 HCVcc系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，過表達α-actinin可顯著增加HCV RNA水平及非結構蛋白表達；抑制α-actinin的表達使HCV非結構蛋白從脂筏脫落、HCV RNA水平下降，提示α-actinin可參與HCV復制，且具有普遍性，不局限于某HCV亞型。

α-actinin可能參與HCV復制復合體在脂筏上的形成。與一般甘油磷脂膜結構不同，脂筏富含膽固醇和鞘磷脂成分，使其可在低溫下抵抗非離子去污劑NP-40的作用。脂筏主要功能是參與信號轉(zhuǎn)導和胞內(nèi)小分子膜運輸，一些病毒利用脂筏的特殊性和功能來進行入胞、裝配等[13, 14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCV復制子中α-actinin定位于脂筏，當其表達受抑制，NS5A 對非離子去污劑敏感而易從脂筏脫落；免疫熒光實驗也顯示NS5A與calnexin共定位消失。由于α-actinin在細胞微絲骨架與細胞膜結構的相互作用中起橋梁作用，推測其有助于HCV復制復合體錨定于細胞骨架或膜狀結構，在亞細胞隔間促進、聚集復制復合體組成蛋白而形成高效復制復合體。此外，有研究表明，破壞肌動蛋白網(wǎng)絡(actin network)可導致脂筏標志分子caveolin-2對非離子去污劑敏感，提示脂筏可能受破壞[15]。α-actinin屬肌動蛋白交聯(lián)蛋白家族，可通過肌動蛋白結合結構域(actin-binding domain，ABD)與F-肌動蛋白結合，形成α-actinin交聯(lián)肌動蛋白網(wǎng)絡[16]。因此，α-actinin是否通過其介導形成的肌動蛋白網(wǎng)絡影響脂筏形成，參與HCV復制復合體在脂筏膜上的定位和完整性，進而調(diào)控HCV復制值得進一步深入研究。

HCV replicon cells were transfected with control siRNA (a) or siRNA-actinin (b). At 48 h post-transfection, the cells were collected for membrane flotation and immunofluorescence analysis. A: Immunoblotting analysis of protein expression level with antibodies against NS5A and actinin. B: The cells were immunostained against NS5A and calnexin, followed by the addition of secondary antibodies conjugated with cy3 (red), Alexa 488 (green), and DAPI (blue). Scale bar, 10 μm.

圖4α-actinin表達降低影響HCVNS5A的膜定位

Fig.4Knockdownofα-actininaffectedlocationofHCVNS5Aindetergent-resistantmembraneandendoplasmicreticulum

已有報道認為一些病毒如Andes virus (ANDV)的復制依賴肌動蛋白網(wǎng)絡，肌動蛋白多聚化抑制劑細胞松弛素D(cytochalasin D)影響病毒N蛋白的核周定位并下調(diào)病毒RNA水平[17]。Bost等發(fā)現(xiàn)肌動蛋白多聚化抑制劑可顯著抑制HCV RNA的合成；Lai等也發(fā)現(xiàn)HCV的NS3和NS5A可結合肌動蛋白，當其完整網(wǎng)絡結構被破壞后，將影響NS5A與calnexin共定位，推測HCV非結構蛋白依賴于肌動蛋白網(wǎng)絡而在胞質(zhì)內(nèi)進行亞細胞器定位和運輸[15]。α-actinin與肌動蛋白網(wǎng)絡密切相關，是否由其交聯(lián)形成肌動蛋白網(wǎng)絡，通過影響復制復合體組成蛋白的亞細胞定位，從而影響HCV復制復合體的形成，并參與HCV復制，值得進一步研究。

脂滴與HCV裝配密切相關。雖然HCV包裝和釋放過程仍不清楚，但普遍認為HCV NS5A被招募至脂滴結構，通過創(chuàng)造有利于HCV包裝的微環(huán)境和介導RNA與核衣殼的組裝參與裝配[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，α-actinin影響NS5A的亞細胞定位，推測NS5A可能通過α-actinin介導的細胞骨架被運輸至脂滴結構，參與HCV裝配。

綜上所述，在前期研究發(fā)現(xiàn)α-actinin參與HCV亞基因組復制的基礎上，本研究進一步證實α-actinin可通過影響HCV復制復合體中組成蛋白的脂筏定位而參與HCV復制。下一步將對HCV如何利用α-actinin參與其復制的分子機制進行研究。

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