人乳頭瘤病毒基因分型方法的進(jìn)展

朱邦勇，李偉

廣西皮膚病防治研究所，南寧 530003

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種可侵犯人類上皮細(xì)胞，引起皮膚和黏膜組織良性及惡性病變(如宮頸癌)的病毒[1,2]，而且生殖道感染HPV的孕婦在分娩過程中可導(dǎo)致新生兒感染[3]。HPV有100多個(gè)型別，不同型別的生物學(xué)行為及致病能力各不相同。高危型[4](與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤病變有關(guān))包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，共13種亞型；低危型(與外生殖器尖銳濕疣等良性病變有關(guān))包括HPV 6、11、42、43、44，共5種亞型。HPV基因分型對(duì)HPV疫苗的研究、分子流行病學(xué)控制措施的制定、HPV感染的治療及預(yù)后判斷具有重要作用。HPV是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒。8個(gè)高度重疊的開放讀碼框架(open reading frame，ORF)由早期基因、晚期基因和1個(gè)不翻譯的上游調(diào)節(jié)區(qū)3部分組成。早期基因編碼E1～E7共7個(gè)早期蛋白，主要參與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控及細(xì)胞轉(zhuǎn)化。其中E6和E7基因能使細(xì)胞從正常向惡性轉(zhuǎn)化，其蛋白產(chǎn)物具有干擾抑癌基因的功能。E6能結(jié)合P53，并促進(jìn)其降解。E7能結(jié)合并拮抗抑癌蛋白pRB，從而干擾其抑制細(xì)胞分裂和增殖的作用。晚期基因L1和L2分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。HPV各型有共同抗原，即屬特異性抗原，存在于L1蛋白，與牛乳頭病毒(bovine papillomavirus，BPV)有交叉反應(yīng)。對(duì)HPV分子生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)為分子診斷奠定了基礎(chǔ)[5]。目前HPV分型方法主要有雜交法和以聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)為基礎(chǔ)的分型法兩大類。本文就這兩類分型方法作一綜述。

1 雜交法

1.1 直接雜交分析

直接雜交分析是最先用于HPV檢測(cè)的分子診斷方法，包括原位雜交(insituhybridization，ISH)、Southern印跡法、斑點(diǎn)雜交法等。宮頸刮片或活檢標(biāo)本中HPV可應(yīng)用ISH法檢測(cè)，該法和(或)其他標(biāo)志物可對(duì)感染樣品中的HPV單獨(dú)或共同定位，但HPV分型鑒定仍需不同型的特異性探針進(jìn)行多次ISH分析。ISH法測(cè)定HPV的主要缺點(diǎn)是敏感度很低[6]。將HPV DNA從臨床標(biāo)本中直接分離出來后，采用Southern印跡或斑點(diǎn)雜交進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)不到臨床所需靈敏度，且操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、耗力、需大量高度純化的DNA，不適合臨床HPV分型的檢測(cè)和大通量臨床樣品的篩查，目前較少使用。

1.2 雜交捕獲法

雜交捕獲法Ⅱ(hybrid captureⅡ，HCⅡ)是美國Digene公司研究的HPV DNA檢測(cè)技術(shù)，通過一種非放射性核素(同位素)信號(hào)放大系統(tǒng)，使標(biāo)記的RNA探針結(jié)合HPV DNA，形成DNA-RNA雜交體；后者被微孔板捕獲并與特異性單克隆抗體及化學(xué)發(fā)光底物結(jié)合，堿性磷酸酶作用底物發(fā)光，依據(jù)熒光強(qiáng)度半定量DNA，與熒光實(shí)時(shí)定量PCR法結(jié)果相吻合[7]。該技術(shù)使用2種特異性探針，低危型探針檢測(cè)HPV6、11、42、43和44，高危型探針檢測(cè)HPV16、18、31、33、39、45、51、52、56、59和68，不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增而直接檢測(cè)。HCⅡ?yàn)槟壳拔ㄒ灰陨唐沸问教峁┑那矣凶銐蚩茖W(xué)證據(jù)支持臨床應(yīng)用的檢測(cè)系統(tǒng)，獲美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)證，已成為許多國家的標(biāo)準(zhǔn)方法并廣泛應(yīng)用于臨床研究中。該法的缺點(diǎn)是只能進(jìn)行高危與低危型分組鑒定，而不能進(jìn)行個(gè)體基因分型；兩組混合探針間存在的交叉反應(yīng)也影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性[8]。隨著對(duì)HPV研究的深入，需要對(duì)HPV特定基因型進(jìn)行鑒定，該法不能用于如型特異性疫苗或型特異性藥物的研究和療效觀察。雜交捕獲法Ⅲ(HCⅢ)是Digene公司研制的新一代捕獲雜交法。同樣采用RNA探針技術(shù)，使用一段帶有生物素的寡核苷酸代替特異性抗體，將RNA-DNA雜交體固定在鏈霉素包被的孔中。HCⅢ能特異檢測(cè)出靶序列中單個(gè)核苷酸的改變，從而使HPV基因型變異體的檢測(cè)成為可能。但HCⅢ也是使用混合探針，故不能對(duì)HPV進(jìn)行分型。

2 基于PCR的檢測(cè)方法

PCR是應(yīng)用最廣泛的基因擴(kuò)增方法，具有快速、方便、敏感度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)HPV DNA有2種不同的PCR方法，即通用和型特異引物PCR。目前認(rèn)為以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法是進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)及分型的最好方法。

2.1 通用引物PCR

通用引物PCR是使用通用引物來擴(kuò)增廣譜的HPV，引物針對(duì)HPV基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。確定這個(gè)保守序列需要來自每個(gè)HPV型別的許多序列。在HPV基因組中，L1區(qū)最保守[9]。目前有3種不同的通用引物設(shè)計(jì)方案用于擴(kuò)增廣譜HPV DNA：①在基因組保守序列區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)只完全匹配1種或幾種HPV型別的引物，PCR必須在較低的退火溫度下進(jìn)行。②采用一組簡(jiǎn)并引物如MY09/11，PCR也必須在較低的退火溫度下進(jìn)行。該組引物中含有簡(jiǎn)并堿基，因在其合成時(shí)摻入某個(gè)核苷酸有很大的隨機(jī)性，故很難保證各批引物間的均一性，從而影響擴(kuò)增的效率和重復(fù)性。③在基因的同一位置設(shè)計(jì)幾對(duì)正向/反向引物，這些引物不含簡(jiǎn)并堿基但含黃嘌呤，如SPF10、MY09/11及PGMY。因黃嘌呤可與任何堿基匹配，故合成的引物具有較好的重復(fù)性，且PCR可在優(yōu)化的退火溫度下進(jìn)行。因此，無論對(duì)較新的HPV型別，還是對(duì)已知的生殖道HPV型別，PGMY和SPF10的擴(kuò)增效率要比MY09/11高。此外，待擴(kuò)增片段的大小也影響PCR擴(kuò)增的效率。總的來講，PCR效率隨擴(kuò)增片段的延長(zhǎng)而降低。加之有些臨床標(biāo)本經(jīng)過醛固定、石蠟包埋等處理后，DNA已遭不同程度的降解，不利于較大片段產(chǎn)物的合成。因此，在上述這些引物中，SPF10擴(kuò)增HPV DNA的效率最高(65 bp)，GP5+/6+次之(150 bp)，PGMY位列第3(450 bp)，MY09/11則列最后(450 bp)[10]。

2.2 型特異引物PCR

應(yīng)用某個(gè)HPV型別的特異性引物檢測(cè)臨床標(biāo)本，必須單獨(dú)進(jìn)行多個(gè)型特異的PCR反應(yīng)。為此Yamaguchi等重新設(shè)計(jì)了通用引物(E6CF4/E7CR3)和5種主要的高危型HPV型特異正向引物，建立了HPV PCR/微量熒光分析法。標(biāo)本中總HPV DNA用該通用引物擴(kuò)增后，經(jīng)SYBR Green Ⅰ染色，以485/538 nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷HPV的有無。若為陽性，再用5種型特異引物同時(shí)擴(kuò)增該標(biāo)本中的HPV DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，根據(jù)型特異PCR的片段大小，即可鑒定相應(yīng)基因型；或分別用不同型特異引物擴(kuò)增HPV DNA，再與檢測(cè)總HPV DNA一樣，鑒定標(biāo)本中是否存在特定的HPV型別。該法工作強(qiáng)度大、費(fèi)用昂貴、型特異PCR必須證明有效，而且無法檢測(cè)新的HPV亞型。

2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

熒光實(shí)時(shí)定量PCR是近幾年發(fā)展的技術(shù)，既保持了PCR靈敏、快速的特點(diǎn)，又克服了PCR存在的假陽性污染和不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)，此外還有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。目前主要有單通道和多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR。單通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR在反應(yīng)中使用一種熒光物質(zhì)示蹤，技術(shù)難度相對(duì)較低，但每次反應(yīng)僅能檢測(cè)1個(gè)基因，無法實(shí)現(xiàn)一次反應(yīng)檢測(cè)多個(gè)基因。在HPV型別分析時(shí)，需重復(fù)對(duì)樣本進(jìn)行多次PCR操作，大大增加了工作量及檢測(cè)成本，因此在HPV感染的臨床應(yīng)用中受到限制。多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HPV DNA是通過多種具有不同激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)的熒光物質(zhì)標(biāo)記或通過特異性探針示蹤，實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)對(duì)不同基因型別的檢測(cè)[11]。目前國外已有成型試劑盒(AB Analitica的RQ-HPV-PCR試劑盒)上市，經(jīng)國內(nèi)600例臨床試驗(yàn)研究，特異度達(dá)99.7%，靈敏度為100%，重復(fù)性好；分型的同時(shí)還可準(zhǔn)確定量，結(jié)果直觀、可靠、客觀性強(qiáng)，適用于臨床HPV感染篩查和宮頸病變程度預(yù)測(cè)以及患者術(shù)后療效觀察。

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行的凝膠電泳或測(cè)序分析可用于HPV DNA的檢測(cè)或分型。①PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法：能檢測(cè)所有型別，并可避免雜交反應(yīng)所固有的交叉反應(yīng)，是一種比較可靠的HPV基因分型方法，特別是可檢測(cè)出少見型別或發(fā)現(xiàn)新的型別。但在同時(shí)分析多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物中不同的DNA序列時(shí)，該法不是十分靈敏，尤其是對(duì)HPV混合感染的臨床樣品。②PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)：用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生大小不同的DNA片段，再通過凝膠電泳分析這些片段，根據(jù)電泳帶型可區(qū)分不同的HPV型別[12,13]。這種方法簡(jiǎn)單、易行，不需特殊昂貴的儀器和設(shè)備，費(fèi)用低。但RFLP對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性要求比較高，非特異性條帶的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致酶切后分型的不確定性；另外還需適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，對(duì)混合感染的臨床標(biāo)本分析更為復(fù)雜。③PCR的雜交分析：微孔板雜交或反向線性雜交法。將PCR產(chǎn)物同時(shí)與多個(gè)寡核苷酸探針固定在固相上，將其與液相中的PCR產(chǎn)物雜交，通過一次分析就可同時(shí)檢出若干HPV基因型。因此，雜交分析是最常用的檢測(cè)PCR產(chǎn)物序列的方法。型特異雜交法敏感度較高，一次可檢測(cè)多個(gè)PCR產(chǎn)物，對(duì)多重感染的檢測(cè)能力較高。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)已知的常見型，對(duì)未知型及變異型HPV無法檢測(cè)，且不能排除雜交固有的問題(即有交叉雜交存在的可能性)。

3 基因芯片

基因芯片是指采用原位合成或直接點(diǎn)樣的方法將DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片、玻璃等介質(zhì)上形成微矩陣，檢測(cè)樣品用熒光分子標(biāo)記后與微矩陣雜交，通過熒光掃描及計(jì)算機(jī)分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表達(dá)信息，以達(dá)到快速、高效、高通量分析生物信息的目的。國外HPV DNA芯片可分析15種高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、69)和7種低危型(HPV6、11、34、40、42、43、44)[14,15]，用于宮頸上皮內(nèi)瘤病變或?qū)m頸癌患者的臨床診斷或流行病學(xué)篩查，比細(xì)胞學(xué)方法更敏感、特異、快速。液相芯片體系是美國Luminex公司開發(fā)的一項(xiàng)專利技術(shù)，結(jié)合了流式細(xì)胞技術(shù)及基因芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，主要包括3個(gè)步驟：①探針分子的固定；②將這種標(biāo)記好探針的球形基質(zhì)與樣品反應(yīng)，探針可與相應(yīng)的靶分子特異性結(jié)合，帶有綠色熒光的報(bào)告分子也與靶分子特異性結(jié)合，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行定量；③反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)。該法具有通量高、速度快、靈活性好、操作簡(jiǎn)便、不需洗滌、耗時(shí)短等特點(diǎn)。理論上Luminex法可檢測(cè)1個(gè)樣本中100種不同目的分子，35～60 min內(nèi)可對(duì)96個(gè)不同的樣本進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高、信噪比好，只需微量樣品即可檢測(cè)，且價(jià)格低廉，可廣泛用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查、臨床樣本篩查、治療干預(yù)監(jiān)視和疫苗效果評(píng)價(jià)[16,17]。

4 結(jié)語

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，HPV分型方法不斷涌現(xiàn)，好的方法要有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好、價(jià)格低廉和客觀性強(qiáng)等特點(diǎn)。由于不同分型方法有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，可根據(jù)不同需要，選擇合適、有效的分型方法滿足實(shí)驗(yàn)要求。HCⅡ檢測(cè)方法雖然成熟，但靈敏度不高且有較高的漏檢率等，需進(jìn)一步完善。常規(guī)PCR需制樣、擴(kuò)增及檢測(cè)等步驟，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。熒光實(shí)時(shí)定量PCR特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，分型的同時(shí)還可準(zhǔn)確定量，結(jié)果直觀、可靠。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序和RFLP不僅可檢測(cè)具體型別，還可檢測(cè)所有型別，作一定改進(jìn)后有較大的發(fā)展前景。HPV DNA芯片因具備快速、高效、高通量的分析能力，可廣泛用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查、臨床標(biāo)本篩查、治療干預(yù)監(jiān)視和疫苗效果評(píng)價(jià)。

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