TGF-β1影響人牙周膜成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-1的初步研究

[摘要]目的:研究轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在體外對人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPDLFs)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)的影響，進(jìn)而探討TGF-β1對HPDLFs分泌MMP-1的調(diào)控作用，以期為通過生物學(xué)途徑建立防治正畸過程中牙根吸收的有效方法提供理論依據(jù)。方法:原代培養(yǎng)HPDLFs，取傳代至第5代HPDLFs實(shí)驗(yàn)。設(shè)立TGF-β1工作濃度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml;0ng/ml TGF-β1為空白對照組;選取4h、8h、12h、24h、48h 5個時間點(diǎn)收獲上清液。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (enzyme-linked-immunosorbent serologic assay，ELISA)法檢測各樣本中MMP-1含量。采用多元線性回歸方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果:MMP-1分泌量與TGF-β1作用時間總體上存在時間依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05。但各作用時間下MMP-1分泌量與TGF-β1工作濃度并沒有表現(xiàn)出一致的劑量依賴關(guān)系;4h時各實(shí)驗(yàn)組MMP-1分泌量隨TGF-β1濃度的遞增而下降; 8h、12h、24h時，各實(shí)驗(yàn)組MMP-1分泌量與TGF-β1工作濃度基本呈正相關(guān);48h時各組MMP-1含量變化較大沒有明顯趨勢。結(jié)論:MMP-1分泌量與TGF-β1作用時間存在顯著時間依賴性，TGF-β1可通過促進(jìn)MMP-1分泌參與正畸過程中牙根吸收的發(fā)生和發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]牙根吸收;轉(zhuǎn)化生長因子β1;基質(zhì)金屬蛋白酶-1;牙周膜成纖維細(xì)胞

[中圖分類號]R783 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)02-0245-05

The preliminary study of TGF-β1 effect onhuman periodontal ligament fibroblasts secreting MMP-1

LIU Qi1，CAO Jun1，LI Zhi-dong2，XIE Han3，LIU Xin-wei1，XU Jing4，LI Xin-ping5

(1. Department of Orthodontics， School of Stomatology of Fourth Military Medical University， Xi’an 710032，Shaanxi，China;2. Department of Microorganism of Fourth Military Medical University;3. Department of Periodontics， School of Stomatology of Tongji University;4. stomatological hospital of Xi’an Second Hospital;5. Department of Stomatology affiliated to Naval Command College)

Abstract:Objective To investigate the biological effects of transforming growth factor-β1(TGF-β1) on human periodontal ligament fibroblasts(HPDLFs) secreting matrix metalloproteinase-1(MMP-1). Methods HPDLFs were exposed to TGF-β1 at various concentrations(0.03ng/ml，0.05ng/ml，0.07ng/ml and 0.09ng/ml) in monolayer cultures.The levels of MMP-1 secreted by the TGF-β1-treated HPDLFs were measured using an enzyme-linked immunosorbent assay.Differences between experimental and contol groups were tested using multiple linear regression analysis.ResultsOur data demonstrate TGF-β1 treatment significantly increased the secretion of MMP-1 in a time-dependent manner(P<0.05). However，differently concentrated TGF-β1 effect HPDLFs secreting MMP-1 differently at each moment. ConclusionThe secretion of MMP-1 is regulated by TGF-β1. TGF-β1 play an important role in root resorption during orthodontic tooth movement.

Key words:root resorption;TGF-β1;MMP-1;HPDLFs

牙根吸收是正畸治療過程中的常見并發(fā)癥。有學(xué)者認(rèn)為幾乎所有的正畸患者都存在某種程度的牙根吸收[1-2]。雖然大部分牙根吸收沒有明顯的臨床癥狀，但嚴(yán)重者則可能危害牙齒與牙周組織健康，因此正畸醫(yī)師必須對根吸收有足夠的認(rèn)識。大部分關(guān)于牙根吸收與正畸治療關(guān)系的研究表明， 基質(zhì)金屬蛋白酶在牙周組織改建過程中起著至關(guān)重要的作用，其中屬于膠原酶類的MMP-1參與了細(xì)胞外I、II、III、VII，X 型膠原纖維的降解，其表達(dá)分泌與牙周組織改建、牙根吸收的發(fā)生密切相關(guān)。本研究旨在通過檢測TGF-β1對人牙周膜成纖維細(xì)胞分泌MMP-1的調(diào)控，進(jìn)而篩選出與正畸過程中牙根吸收發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物因子，以備進(jìn)一步建立牙根吸收的防治策略。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料:①細(xì)胞培養(yǎng)用10%胎牛血清αMEM培養(yǎng)液含雙抗(100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素)、無血清αMEM培養(yǎng)液含雙抗(100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素)、胰酶、膠原酶、磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)均由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院組織工程實(shí)驗(yàn)中心提供;②TGF-β1購自美國Peprotech公司，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司代購，純度>98%;③人基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)酶聯(lián)檢測試劑盒(ELISA Kit)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(預(yù)包被)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法:

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):原代培養(yǎng)HPDLFs，取14歲男性青少年因正畸治療需要拔除的雙側(cè)下頜第一前磨牙。拔牙術(shù)前拍攝根尖X線片并進(jìn)行詳盡的牙周檢查，確定該患者雙側(cè)下頜第一前磨牙發(fā)育完好，牙周組織健康。術(shù)后用PBS反復(fù)沖洗牙齒，刮取根中1/3處的牙周膜組織，眼科剪剪碎，至0.5～1mm大小，后用10%胎牛血清αMEM培養(yǎng)液沖洗已剝離組織3次;為使HPDLFs順利從組織塊中爬出，使用膠原酶消化20min，4×鏡下觀察見組織塊形態(tài)松散，終止消化，離心移去上清;提取組織，置于6孔板中，玻片加壓，加入適量10%胎牛血清αMEM培養(yǎng)液，后移至37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。每隔24h鏡下觀察細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞自組織塊邊緣游出，成片生長至6孔板底面積80%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每48h給細(xì)胞換液，取第5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2各實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞上清樣本收集:根據(jù)所購生物因子TGF-β1說明書指示，設(shè)立TGF-β1工作濃度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml，即為4個實(shí)驗(yàn)組;采用0ng/ml TGF-β1為對照組。取傳代至第5代HPDLFs，消化重懸，接種于小方瓶中。將加有上述各濃度TGF-β1 10%胎牛血清αMEM培養(yǎng)液分別加至小方瓶，每瓶4ml，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。分別于細(xì)胞培養(yǎng)至4h、8h、12h、24h、48h各時間點(diǎn)收獲上清液，每組取200μl，后立即置入-20℃低溫冰箱凍存。

1.2.3雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測MMP-1含量:通過雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測各樣本上清中MMP-1含量。根據(jù)試劑盒說明書指示:抗人MMP-1單抗已包被于酶標(biāo)板上(48孔 預(yù)包被);將ELISA檢測試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入酶標(biāo)板第1、2列;第2列為復(fù)本，以求減小誤差;通過倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 (孔H1、H2為空白對照)。

將各實(shí)驗(yàn)組、對照組樣本上清液按布孔設(shè)計(jì)依次添加至酶標(biāo)板各孔，37℃孵育120min，洗板，濾干;加入一抗工作液，每孔50μl，37℃孵育60min，洗板，濾干;加入酶標(biāo)抗體工作液，每孔100μl，37℃孵育60min，洗板，濾干;每孔加入底物工作液100μl，置37℃暗處反應(yīng)7min;肉眼觀察酶標(biāo)板已有顯色反應(yīng)，每孔加入50μl終止夜終止反應(yīng);在492nm處測吸光值。以上各步驟均嚴(yán)格遵照檢測試劑盒說明書操作。

1.2.4數(shù)據(jù)處理:使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包，將所測得MMP-1含量用多元線性回歸方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1 HPDLFs原代培養(yǎng)情況:原代培養(yǎng)細(xì)胞從組織塊中爬出時間為10～14天。鏡下觀察見:細(xì)胞以組織塊為中心，呈放射狀排列生長，局部形成生長暈，細(xì)胞呈長梭形或多突起星形，胞突細(xì)長，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，核圓形或卵圓形，核仁清晰。由細(xì)胞形態(tài)和組織來源鑒定該細(xì)胞確為人牙周膜成纖維細(xì)胞。傳代后細(xì)胞生長旺盛，狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定。

2.2 各實(shí)驗(yàn)濃度TGF-β1對HPDLFs分泌MMP-1的影響:結(jié)果R2值為0.999，說明此次ELISA檢驗(yàn)方法嚴(yán)格遵循操作步驟，結(jié)果真實(shí)可靠。選取由已建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程y= 0.197x2 + 0.775x-0.046。R2=0.999 作為標(biāo)準(zhǔn)方程，用Excel換算出酶標(biāo)板各孔。

經(jīng)由多元線性回歸分析得出，以0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，MMP-1分泌量與所設(shè)立TGF-β1作用時間梯度存在線性正相關(guān)關(guān)系。 線性方程:y=0.003+0.002x P=0.033<0.05，方程中y為各樣本上清液中MMP-1含量，x為時間。

3討論

正畸治療中牙齒移動是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，是不同組織、細(xì)胞和生物因子共同作用的結(jié)果[2-3]。HPDLFs是牙周膜中數(shù)量最多，功能最重要的細(xì)胞，參與牙周組織改建、再生。多種生長因子可通過不同的生物學(xué)機(jī)制調(diào)節(jié)HPDLFs的活性，進(jìn)而影響牙周組織改建。

MMPs是一族鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，其主要功能在于降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extra Cellular Matrix，ECM)中的膠原、纖維連結(jié)蛋白等物質(zhì)[3-4]。ECM的正常生理代謝依賴于MMPs及其組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)二者之間的動態(tài)平衡[5]。研究表明，膠原酶(MMP-1)和明膠酶(MMP-2、MMP-9)都是牙根吸收，牙周組織改建過程中的關(guān)鍵酶[6]。MMP-1由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，主要作用底物為I、II、III、VII、X型膠原，明膠，蛋白多糖等[4];在正畸治療牙齒移動過程中對ECM的合成、降解起重要調(diào)控作用。此過程中，首先由破牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌酸，使牙骨質(zhì)脫礦，繼而通過分泌各種酶將殘留的有機(jī)物分解。牙周組織主要纖維成分中I型膠原纖維所占比例最多，少部分為III型[7]，這兩種膠原恰是MMP-1作用的底物;已建立的機(jī)械力所致牙根吸收的動物模型顯示MMPs的合成及分泌有所增加，其齦溝液中MMP-1、MMP-2及MMP-8的水平均高于正常[8];提示MMP-1對牙周組織的代謝有直接調(diào)控作用。此外MMP-1還是MMP-2等其他MMPs的啟動因子，它的活化可啟動一系列酶活性反應(yīng)[4]，進(jìn)而參與牙根吸收。

TGF-β1屬肝素生長因子家族，是一種具有多項(xiàng)調(diào)節(jié)功能的生物因子，在體內(nèi)可同時調(diào)節(jié)多種相關(guān)蛋白的表達(dá)與分泌，影響多種細(xì)胞的生長、分化及功能[9]。研究表明，牙周膜發(fā)育過程中，TGF-β1及其受體在HPDLFs、成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均有較強(qiáng)表達(dá)，提示TGF-β1參與牙周組織發(fā)育、改建等一系列過程，對ECM的合成和降解有重要調(diào)控作用[9]。

那么TGF-β1是通過什么途徑達(dá)到調(diào)控ECM代謝，進(jìn)而影響牙周組織改建，參與牙根吸收的呢?MMP-1作為牙根吸收過程中最為重要的酶之一，其表達(dá)與分泌與牙根吸收的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)，它與TGF-β1有著什么樣的關(guān)系，MMP-1的分泌是否受到TGF-β1的調(diào)控呢?

本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)立TGF-β1對HPDLFs作用的濃度梯度和時間梯度，采用雙抗體夾心ELISA的方法檢測HPDLFs上清中MMP-1的分泌量，以驗(yàn)證HPDLFs分泌MMP-1與TGF-β1的作用是否同時存在劑量依賴性和時間依賴性。結(jié)果表明，MMP-1分泌量與TGF-β1的作用時間總體上存在時間依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P=0.033<0.05(如圖5，見表4);但不同作用時間下，各樣本中MMP-1含量與TGF-β1工作濃度并沒有顯示出一致的劑量依賴關(guān)系。具體分析如下:4h時各實(shí)驗(yàn)組MMP-1的分泌量隨TGF-β1濃度的遞增有總體下降的趨勢(如圖6)。8h時各實(shí)驗(yàn)組MMP-1的分泌量隨TGF-β1濃度的增加而遞增(如圖7)。12h時雖然0.07 ng/ml TGF-β1實(shí)驗(yàn)組MMP-1分泌量較0.05ng/ml實(shí)驗(yàn)組略有下降，但總體上MMP-1在細(xì)胞上清中的含量隨TGF-β1濃度的升高而升高(如圖8)。24h時各實(shí)驗(yàn)組MMP-1分泌量同TGF-β1工作濃度呈正相關(guān)(如圖9)。48h時測得各組MMP-1含量變化較大，可能由于此時細(xì)胞培養(yǎng)時間已較長，細(xì)胞狀態(tài)已不穩(wěn)定所致(如圖10)。在8h、12h、24h時空白對照組MMP-1分泌量均高于TGF-β1最小實(shí)驗(yàn)濃度組0.03ng/ml，推測 TGF-β1濃度為0.03ng/ml時可下調(diào)MMP-1表達(dá)或抑制其分泌。而當(dāng)TGF-β1濃度≥0.05ng/ml時，MMP-1分泌量與TGF-β1濃度存在正相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，HPDLFs分泌MMP-1與TGF-β1作用時間總體上存在時間依賴性，但在不同作用時間下HPDLFs分泌MMP-1對不同TGF-β1工作濃度并沒有表現(xiàn)出一致的劑量依賴關(guān)系。由于本研究樣本量較小，對于TGF-β1影響HPDLFs分泌MMP-1只能作一個初步的探尋性研究，更深入的探討需要在擴(kuò)大樣本量后再繼續(xù)進(jìn)行。

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[收稿日期]2009-11-20 [修回日期]2010-01-25

編輯/何志斌