VEGF基因治療與血管化作用的研究進展

血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前最強有力的血管生成因子[1]，能增加微靜脈、小靜脈的通透性，促進血管內(nèi)皮細胞分裂與增殖，使細胞質(zhì)鈣聚集，誘導血管生成，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長與轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，因此VEGF的血管化作用是機體生理及病理性組織生長和損傷愈合的基礎(chǔ)。本文就VEGF基因治療在血管化方面的作用進展作一綜述，為進一步研究VEGF基因治療與血管化作用提供理論基礎(chǔ)。

1VEGF及其受體

1989年，Connolly等[2]從正常垂體濾泡細胞中分離出了一種能選擇性促進血管內(nèi)皮細胞形成的蛋白質(zhì)，稱之為血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)。VEGF是一個分子量為45000，能與肝素結(jié)合的二聚體糖基化的堿性蛋白，它在多種細胞與血管生成相關(guān)的進程中表達。人的VEGF基因位于染色體的6p21，由8個外顯子及7個內(nèi)含子構(gòu)成，基因全長28kb，編碼基因長14kb，分子量約34～45kD[3]，編碼產(chǎn)物為同源二聚體糖蛋白，等電點為8.5，有很強的耐熱和耐酸能力。目前已發(fā)現(xiàn)的VEGF家族包括七個成員即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF(Placeta Growth Factor，胎盤生長因子)[4]。VEGF-A發(fā)現(xiàn)最早，故多數(shù)文獻中的VEGF即指VEGF-A，在組織和細胞中含量最豐富，功能最強，是以二硫鍵相連的寡二聚體糖蛋白，分子量為35～45KD，經(jīng)過不同的剪切方式可以7種不同的亞型出現(xiàn)，分別是VEGFl21、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206，VEGF165為最主要的同分異構(gòu)體[5]。

血管內(nèi)皮細胞生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)是VEGF特異性的膜受體，具有高親和力，屬于酪氨酸激酶亞家族中的一個新成員。作為一種典型跨膜鑲嵌蛋白，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)及膜內(nèi)區(qū)三部分，以胞外7個免疫球蛋白樣的超二級結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)兩個間開的酪氨酸激酶區(qū)為其特征。目前已知VEGF家族有三個受體:VEGFR-l、VEGFR-2、VEGFR-3，分別由fit-1、flk-1-KDR、fit-4基因編碼[6]，其中VEGFR-2即KDR主要參與血管形成過程[7]。

2VEGF促血管化作用

VEGF最主要的生物學作用是通過和血管內(nèi)皮細胞的特異性受體結(jié)合，從而促進動脈、靜脈以及淋巴管來源的內(nèi)皮細胞生長[8]，其他血管生成因子的作用大多是通過增強VEGF的表達而間接實現(xiàn)。自身內(nèi)源性的VEGF是機體組織損傷恢復重要的血管生長因子，Akira[9]通過實驗證實肌肉損傷后的早期VEGF及其受體的mRNA表達明顯增高，與損傷早期的血管化程度密切相關(guān)，從而也間接說明了VEGF的重要血管化作用。治療性血管生長是針對治療缺血性血管疾病的一個新概念，它包括誘導血管發(fā)生、小動脈生成及淋巴管生成[10]。在血管生長中，VEGF調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞外基質(zhì)溶解、內(nèi)皮細胞遷移、增生和管腔形成。VEGF在多種在體模型中強烈地促血管生成作用已經(jīng)被多個實驗證實[11]。

3VEGF基因治療途徑的發(fā)展

VEGF的半衰期很短，僅為數(shù)小時甚至更短，Shima等[12]認為VEGF165的生物半衰期在正常氧分壓下是30～45min，在低氧下是6～8h。由于VEGF生物半衰期短，注入體內(nèi)易稀釋，故外源給予VEGF蛋白質(zhì)進行治療效力有限，為克服單純蛋白質(zhì)治療的缺點，人們考慮應(yīng)用VEGF基因治療，即將外源VEGF基因?qū)肽康募毎⒂行П磉_，從而達到治療目的。近20年來，VEGF基因治療方法得到了不斷發(fā)展?；蛑委熜枰线m的載體，目前被研究應(yīng)用最多的是腺病毒載體，有實驗證實重組腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、轉(zhuǎn)染效率高、體外轉(zhuǎn)染安全[13]。實踐中遇到的問題是導入的基因難以在體內(nèi)持續(xù)表達，有些難以獲得有效基因轉(zhuǎn)移，體外細胞增殖困難，自體細胞來源少及再移植后存活率低等。于是，Sun[14]和Chang等[15]提出了異體細胞基因治療的策略，即將目的基因?qū)胍呀⒌募毎祪?nèi)，使其表達基因產(chǎn)物，再將其移入患者體內(nèi)。這種方法雖然擴展了細胞來源，但是免疫排斥反應(yīng)又限制了其應(yīng)用，同時為了增加重組基因工程細胞數(shù)量，多采用具有高分裂活性的細胞株，易形成腫瘤。隨著微囊化技術(shù)的出現(xiàn)，人們嘗試應(yīng)用該技術(shù)，將重組基因細胞用微囊包裹后進行移植，以此外源基因為模板，轉(zhuǎn)基因細胞為加工廠，在體內(nèi)編碼生產(chǎn)治療性蛋白[16-17]。微囊化技術(shù)既克服了免疫排斥反應(yīng)，又限制了鄰近細胞過度增殖，使同種異體移植成為可能，微囊化VEGF基因修飾細胞移植可為VEGF治療性血管化提供新的思路和途徑[18]。

此外，聯(lián)合應(yīng)用其他血管生長因子進行基因治療也是VEGF基因治療的一個方向。Lei等[19]應(yīng)用一新的含VEGF165和血管生成素-1(angiopoietin-1)腺病毒雙順反子載體，經(jīng)人骨骼肌成肌細胞遞送，注射到豬心肌梗塞模型的心肌內(nèi)，結(jié)果顯示在豬心臟產(chǎn)生了更大比例的具有功能的成熟血管，增強了血管化作用。

4VEGF基因治療在血管化作用方面的應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 對缺血性疾病的治療作用:VEGF能改善缺血性肢體的循環(huán)狀態(tài)，Shimpo等[20]利用大鼠缺血性肢體模型，采用腺病毒相關(guān)病毒(AAV)介導的VEGF轉(zhuǎn)染可促進毛細血管增生，增加肢體的血流量。在治療心血管疾病方面，Rutanen等[21]通過實驗證實，VEGF基因轉(zhuǎn)染明顯增強了心臟室壁血管形成，改善了心肌的灌注。前體促血管形成因子基因治療難愈癥狀性冠狀動脈疾病和周圍血管疾病的患者，可促進新生血管生長[22]。VEGF基因治療可促進皮瓣成活，O'Toole等[23]將VEGF165 cDNA表達質(zhì)粒注入缺血性大鼠的腹壁皮瓣下，結(jié)果表明VEGF治療組較對照組皮瓣成活面積大。目前已經(jīng)發(fā)展到聯(lián)合應(yīng)用細胞治療和VEGF基因治療，已證實可有效增強不同的動物模型血管化[24]。

4.2 在創(chuàng)面愈合方面的作用:損傷組織的再血管化是創(chuàng)面愈合的重要組成環(huán)節(jié)。Galeano等[25]將小鼠造成Ⅱ度燙傷，在創(chuàng)面邊緣注射含目的基因VEGF165的重組AAV14天后檢測，治療組創(chuàng)面VEGF表達水平明顯高于對照組，內(nèi)皮細胞增生、血管形成及細胞外基質(zhì)的成熟情況等都優(yōu)于對照組。另外，對于一些缺血性、慢性難愈創(chuàng)面，如糖尿病合并慢性潰瘍等，VEGF基因治療顯示了潛在的應(yīng)用前景[26]。Yoon等[27]應(yīng)用超聲介導的小環(huán)VEGF165 DNA基因治療糖尿病鼠皮膚創(chuàng)面是有效的。

4.3 對腫瘤方面的應(yīng)用:VEGF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起到了很大作用，因而VEGF基因治療可應(yīng)用于腫瘤防治，目前主要是采用反義寡核苷酸或反義RNA技術(shù)，在基因水平或翻譯水平抑制VEGF的表達，從而達到抗腫瘤血管生成的目的。Buchler等[28]應(yīng)用反義VEGFR基因治療胰腺癌發(fā)現(xiàn)，反義VEGFR-2基因可明顯抑制VEGF誘導的腫瘤細胞的過度生長。

4.4對移植組織的血管化作用:通過基因轉(zhuǎn)染使VEGF超量表達，可能成為提高移植皮膚替代物成活率的一條新途徑。在促進皮膚移植物血管化方面，韓焱福等[29]通過腺病毒介導的VEGF基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，結(jié)果顯示體內(nèi)外均可有效表達目的基因，并可促進移植組織血管新生。Paolo等[30]通過實驗研究顯示，能表達VEGF的重組肌肉細胞與肌肉組織同時移植，可顯著增加新生血管和肌肉的體積。

5問題及展望

5.1 VEGF基因治療生成的血管是否穩(wěn)定:對于缺血性心肌及肢體缺血等疾病，足夠而穩(wěn)定的新生血管對于治療結(jié)果很關(guān)鍵。VEGF重組腺病毒表達時間短暫，約4～5周，雖然這段時間足以誘導新生血管的形成，但尚不知在血管生成因子的生成停止以后，這些新生血管是否持續(xù)存在。另外，體內(nèi)VEGF受到許多細胞因子的調(diào)控，包括上調(diào)和下調(diào)，如IL-1a、IL-1b、bFGF、IL-4、IL-10、IFN-γ等[31-32]。

5.2 VEGF基因治療的安全性:從理論上講，轉(zhuǎn)基因治療后VEGF的表達有可能促進現(xiàn)階段未被發(fā)現(xiàn)的小腫瘤生長。但迄今在應(yīng)用VEGF進行基因治療的患者中，還未見發(fā)生危險的相關(guān)報道。VEGF還有一些常見的副作用，如VEGF誘導NO釋放，引起短暫性低血壓;VEGF增加血管通透性，導致周圍性水腫;VEGF的應(yīng)用可能會促進病理性血管生成，引發(fā)或加速病變發(fā)展。因此，關(guān)于VEGF基因治療的遠期安全性還需要進一步研究和觀察。

5.3 展望:促進VEGF高表達的基因治療，在缺血性疾病等方面已顯示出一定的效果。由于血管生成在組織再生和損傷修復中的重要作用，應(yīng)用VEGF基因治療在促進組織再生、傷口愈合及加速移植物特別是組織工程器官血管化等方面可望有良好的應(yīng)用前景。VEGF基因治療的途徑也在不斷地改進，如超聲介導的VEGF質(zhì)粒微泡可靶向性地轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，可改善嚴重慢性缺血組織的灌流，被證明是一種很有前景的無創(chuàng)技術(shù)[33]。而微囊化轉(zhuǎn)VEGF基因細胞移植作為一種新的生物投遞技術(shù)，也將在組織移植血管化與創(chuàng)面修復方面發(fā)揮積極的作用[34]。目前這方面的研究還在探索中，必須進一步考察微囊在體內(nèi)的長期轉(zhuǎn)歸，囊內(nèi)細胞生存以及探究最佳移植方法。

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[收稿日期]2009-12-14 [修回日期]2010-01-27

編輯/李陽利