尋常型白癜風(fēng)患者外周血IL-17mRNA的檢測(cè)及其臨床意義

[摘要]目的:探討IL-17mRNA在尋常型白癜風(fēng)患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義。方法:采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法對(duì)21例進(jìn)展期白癜風(fēng)患者、23例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者及30例健康對(duì)照外周血IL-17mRNA含量進(jìn)行檢測(cè)，并分析其表達(dá)水平與疾病病程與皮損面積的相關(guān)性。結(jié)果:進(jìn)展期白癜風(fēng)患者外周血IL-17mRNA的水平與健康對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)，穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者IL-17mRNA的水平與健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。白癜風(fēng)患者IL-17mRNA的含量與病程無(wú)相關(guān)性(r=0.15，P>0.05)，與皮損面積呈正相關(guān)(r=0.54，P<0.05)。結(jié)論:IL-17在白癜風(fēng)發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮一定的作用。

[關(guān)鍵詞]白癜風(fēng);IL-17;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

[中圖分類號(hào)]R758.4+1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)02-0225-04

Serum level of IL-17mRNA in patients with vitiligo and its clinical significance

WANG Luan，YANG Hui-lan，F(xiàn)AN Jian-yong

(Department of Dermatology，the General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，Guangdong，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the level of IL-17mRNA in peripheral blood of patients with vitiligo.Methods21 cases of advanced vitiligo patients，23 cases of stable vitiligo patients and 30 healthy controls were enrolled in this study. The level of IL-17mRNAwas detectedby using real-time PCR andthe relevance with the course of disease andlesion area were conducted by correlation analysis using spss 13.0 software.ResultsThe level ofIL-17mRNA in the advanced vitiligowas significantly higher than those of healthy controls(P<0.05).There were no significantly difference between the stable vitiligo and health controls(P>0.05). The level of IL-17mRNAwas no correlation with the course of vitiligo(r=0.15，P>0.05)，and positively correlated with area of skin lesions(r=0.54，P<0.05).ConclusionIL-17may play a role in the pathogenesis of vitiligo.

Key words: vitiligo; IL-17; real-time fluorescence quantitative reversetranscriptase-polymerase chain reaction

白癜風(fēng)是一種以黑素細(xì)胞特異性脫失為特征的皮膚病，其病因和確切發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，自身免疫學(xué)說(shuō)受到越來(lái)越多的關(guān)注。Th17細(xì)胞是一類不同于Th1和Th2的CD4+T細(xì)胞亞群，此類細(xì)胞以分泌IL-17為主而得名。最近的研究表明，Th17細(xì)胞和自身免疫的發(fā)生密切相關(guān)，而其與白癜風(fēng)的發(fā)病是否相關(guān)，目前尚無(wú)報(bào)道。故我們通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)尋常型白癜風(fēng)患者外周血IL-17mRNA含量，并分析其與病程和皮損面積的相關(guān)性來(lái)探討Th17細(xì)胞與白癜風(fēng)的關(guān)系。

1材料和方法

1.1 研究對(duì)象:選取廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科門診2008年10月～2009年6月就診并確診為白癜風(fēng)的44例患者，其中男23例，女21例，平均(30.3±9.6)歲，病程(2個(gè)月～10年)。對(duì)患者按文獻(xiàn)[1]進(jìn)行分型、分期。其中進(jìn)展期21例，穩(wěn)定期23例。泛發(fā)性5例，散發(fā)性21例，局限性12例，肢端性6例。皮損面積在25%及以下的37例，25%到50%的5例，50%以上的2例。所有患者均排除嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎疾病、感染、腫瘤及其它自身免疫性疾病，檢測(cè)前一個(gè)月未接受任何免疫治療。對(duì)照組30例均為本院健康體檢者，其中男17例，女13例，平均年齡(27.2±9.5)歲，與患者組在年齡和性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 主要儀器及試劑:淋巴細(xì)胞分離液:購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;RNA抽提試劑:Trizol，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司;定量檢測(cè)試劑盒:SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit，購(gòu)自日本TaKaRa公司;ABI 7900 HT PCR儀:購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 引物合成及序列:IL-17及內(nèi)參β-actin上下游引物委托TaKaRa生物公司設(shè)計(jì)合成。

IL-17上游引物:5'-CCACCTCACCTTGGAATCTC-3'

下游:5'-CAGGATCTATTGCTGGATGG-3' 產(chǎn)物長(zhǎng)度:205bp

β-actin上游引物:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'

下游:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'產(chǎn)物長(zhǎng)度:184bp

1.4 方法

1.4.1 RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):采集患者及正常人外周靜脈血5ml，EDTA抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液從外周血中分離淋巴細(xì)胞，然后Trizol抽提淋巴細(xì)胞總RNA，核酸測(cè)定儀測(cè)A260/A280，要求在1.8～2.0之間，同時(shí)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):每10μl逆轉(zhuǎn)錄體系中加入上述總RNA200ng作為模板進(jìn)行反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄條件:37℃15min，85℃5s。

1.4.2 SYBR熒光實(shí)時(shí)定量PCR:參照說(shuō)明書設(shè)定的PCR程序:95℃10s變性，然后95℃5s，60℃30s重復(fù)40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增;設(shè)定熔解程序:95℃ 1min，65℃15s，從65℃緩慢升溫至95℃，每升高0.5℃檢測(cè)一次熒光信號(hào)值。反應(yīng)結(jié)束儀器自動(dòng)生成循環(huán)閾值(cyclethreshold，Ct值)及熔解曲線圖。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取其平均值進(jìn)行比較，用IL-17和內(nèi)參基因β-actin Ct值的差值(ΔCt)表示IL-17mRNA的相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 13.0軟件處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用方差分析，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的確定:由目的基因IL-17mRNA和內(nèi)參基因β-actin的擴(kuò)增曲線和熔解曲線(圖1-4)可見(jiàn)，IL-17mRNA和β-actin的擴(kuò)增效率恒定，且均已達(dá)到平臺(tái)期，;相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好;它們的熔解曲線均為單峰特異，引物的特異性好且無(wú)引物二聚體產(chǎn)生。故可以使用該體系對(duì)目的基因IL-17進(jìn)行定量。

2.2 各組白癜風(fēng)患者外周血IL-17mRNA表達(dá)量的比較:21例進(jìn)展期白癜風(fēng)、23例穩(wěn)定期白癜風(fēng)和30例健康對(duì)照的IL-17mRNA表達(dá)量分別為3.232±1.137、1.672±0.896和1.432±0.954。進(jìn)展期白癜風(fēng)患者與健康對(duì)照相比，IL-17mRNA的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.43，P<0.05);進(jìn)展期白癜風(fēng)患者與穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者相比，IL-17mRNA的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.14，P<0.05);穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者與健康對(duì)照相比，IL-17mRNA的含量升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.25，P>0.05)。

2.3 白癜風(fēng)患者IL-17mRNA表達(dá)量與病程及皮損面積的相關(guān)性:采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者外周血中IL-17mRNA的含量與病程無(wú)相關(guān)性(r=0.15，P>0.05);白癜風(fēng)患者外周血IL-17mRNA的含量與皮損面積呈正相關(guān)(r=0.54，P<0.05)。

3討論

當(dāng)CD4+T細(xì)胞接受抗原刺激后，不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)其向不同的亞群分化。例如，當(dāng)局部抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生IL-12時(shí)，尤其在IFN-γ的共同作用下，CD4+T細(xì)胞分化為分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)清除細(xì)胞內(nèi)病原體;當(dāng)局部IL-4存在時(shí)，CD4+T細(xì)胞分化為分泌IL-4、IL-5和IL-13的Th2細(xì)胞，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)清除細(xì)胞外病原體。近期研究發(fā)現(xiàn)了CD4+T細(xì)胞的一種新的分化方向，在抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β1、IL-6和IL-23的共同作用下，分化為Th17細(xì)胞，該細(xì)胞主要分泌IL-17。Th17細(xì)胞在正常免疫反應(yīng)中的作用尚未知，但研究已發(fā)現(xiàn)其在清除特定感染源中發(fā)揮重要作用[2-3]。適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞免疫反應(yīng)可有效清除病原體并產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞，不適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞免疫反應(yīng)或持續(xù)的T細(xì)胞亞群激活可導(dǎo)致自身免疫性或過(guò)敏性疾病，許多研究已證實(shí)過(guò)去認(rèn)為是由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的許多自身免疫性炎癥反應(yīng)其實(shí)是由產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞介導(dǎo)的。IL-17是分子量為20～30ku的糖蛋白，是早期的炎癥因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，它可刺激滑膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、上皮及內(nèi)皮細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8、前列腺素E2、單核細(xì)胞化學(xué)趨化蛋白-1和粒細(xì)胞集落刺激因子等[4]。

熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法作為檢測(cè)mRNA表達(dá)的新技術(shù)，具有高靈敏性，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于分子學(xué)領(lǐng)域的研究[5]。我們采用SYBR-GreenI熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)尋常型白癜風(fēng)患者外周血淋巴細(xì)胞中IL-17mRNA的表達(dá)，該方法在應(yīng)用過(guò)程中需結(jié)合熔解曲線分析來(lái)確定PCR產(chǎn)物的特異性[6]。本試驗(yàn)通過(guò)熔解曲線分析，確定PCR產(chǎn)物特異性好。結(jié)果顯示進(jìn)展期白癜風(fēng)患者外周血淋巴細(xì)胞中IL-17mRNA的含量明顯高于健康對(duì)照，而穩(wěn)定期的患者IL-17mRNA的水平與健康對(duì)照無(wú)明顯差異，IL-17mRNA與白癜風(fēng)的病程無(wú)相關(guān)性，但與白癜風(fēng)的皮損面積呈正相關(guān)，表明IL-17可能參與了白癜風(fēng)的進(jìn)展過(guò)程，既往研究表明，在白癜風(fēng)皮損周圍有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部的炎癥因子IL-6、IL-8可對(duì)黑素細(xì)胞有損傷作用。外周血中炎性細(xì)胞因子IFN-γ 、IL-6、IL-8水平升高[7]。IL-17可能通過(guò)刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生上述炎癥因子而對(duì)黑素細(xì)胞產(chǎn)生損傷，從而導(dǎo)致白癜風(fēng)的發(fā)病，而Th17細(xì)胞作為新的細(xì)胞亞群，是否參與白癜風(fēng)的發(fā)病，尚需更多的研究。

綜上所述，白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，我們通過(guò)對(duì)IL-17mRNA在尋常性白癜風(fēng)患者中的研究，為白癜風(fēng)的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制提供了更多的證據(jù)，為以后提出新的治療方法提供路徑。

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[收稿日期]2009-12-18[修回日期]2010-01-29

編輯/張惠娟