軟骨細胞與骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)裸鼠體內(nèi)構(gòu)建軟骨組織的實驗研究

[摘要]目的:探討軟骨細胞在裸鼠體內(nèi)促進骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)向軟骨分化并形成軟骨組織的可行性。方法:從SD大鼠中分別分離出BMSC和軟骨細胞進行體外培養(yǎng)。收集軟骨細胞培養(yǎng)上清液，作為BMSCs誘導液從第2代開始進行誘導分化，7天后取出標本，免疫組織化學檢測軟骨特異性Ⅱ型膠原表達，RT-PCR檢測Ⅱ型膠原和aggrecan的mRNA表達。SD大鼠BMSCs與軟骨細胞按一定比例(7:3)混勻，取5.0×107個混合細胞/ml的各組細胞懸液接種至殼聚糖生物材料，體外培養(yǎng)一周后植入裸鼠皮下，相同數(shù)量的單純軟骨細胞或BMSCs同樣方法植入，分別作為陽性對照及陰性對照，1.5×107個軟骨細胞同樣植入作為低濃度軟骨細胞對照。各組均8周后取材檢測。結(jié)果:經(jīng)誘導后的大鼠BMSCs的Ⅱ型膠原免疫組化檢測陽性，RT-PCR檢測Ⅱ型膠原和aggrecan mRNA呈陽性表達;混合細胞組及陽性對照組均形成了成熟的軟骨，組織學可見成熟軟骨陷窩、異染基質(zhì)及Ⅱ型膠原表達;BMSCs組僅形成了纖維性組織;低濃度軟骨細胞組在局部形成了少量軟骨。結(jié)論:軟骨細胞能在一定程度上提供軟骨形成的微環(huán)境，誘導BMSCs在裸鼠體內(nèi)向軟骨組織分化并形成軟骨組織。

[關(guān)鍵詞]骨髓基質(zhì)細胞;軟骨細胞;軟骨分化;軟骨形成

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)02-0204-04

In nude mice vivo chondrogenesis of BMSCs induced by Co-transplantation of BMSCs and chondrocytes

MIAO Chun-lei，MU Shao-chun，LIANG Xiao-qin，ZHOU Guang-dong，TANG Sheng-jian

(Institute of Plastic Surgery，Weifang Medical College， Weifang 261041，Shandong，China)

Abstract:ObjectiveTo test the hypothesis that chondrocytes can promote in nude mice vivo chondrogenic differentiation and chondrogenesis of BMSCs at non-chondrogensis site.Methods We separated BMSC and cartilage cells from SD rats and cultured them. The supernatant of cartilage culture was separated as the BMSC inducing solution，and used to induce differentiation of the cells from the 2nd generation. Samples were taken 7 days later， and immunohistochemistry was applied to determine the expression of specific type Ⅱ cartilage collagen. RT-PCR was adopted to detect the expression of type Ⅱcollagen and aggrecan mRNA Porcine BMSCs and auricular chondrocytes were mixed at different ratios (7:3) and 5.0×107 mixed cells/mlwere suspended in chitosan，and then the mixture was imbed into nude mice subcutaneously as experimental groups. Chondrocytes or BMSCs at the same cell number were mixedimbeded respectively as controls. 1.5×107 chondrocytes were imbeded as low concentration chondrocyte control. All samples were collected at 8 weeks post-injection.ResultsAll specimens in experimental groups and chondrocyte group formed mature cartilage with collagen II expression. In contrast， specimens in BMSC group showed mainly fibrous tissue. Only a small amount of cartilage was formed in specimens of low concentration chondrocyte group.ConclusionThese results indicate that chondrocytes can promote in vivo chondrogenic differentiation and chondrogenesis of BMSCs .

Key words:bone marrow stromal cells; chondrocytes; chondrogenic differentiation; chondrogenesis

軟骨缺損或損傷一直是外科臨床治療的難題。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，軟骨組織工程為軟骨缺損或損傷的理想修復提供了新的方法[1]。但種子細胞來源不足嚴重限制了軟骨組織工程的臨床推廣應用。骨髓基質(zhì)細胞 (BMSCs)由于其來源充足，取材損傷小，體外擴增能力強，且具有多向分化潛能，是軟骨組織工程種子細胞的優(yōu)良選擇。許多研究證實:關(guān)節(jié)軟骨微環(huán)境可以促進BMSCs向軟骨細胞分化并形成成熟軟骨組織[1-2]。本研究旨在探討軟骨細胞能否在裸鼠皮下這一非軟骨形成部位提供軟骨誘導微環(huán)境，促進BMSCs向軟骨細胞分化并形成組織工程軟骨。

1材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

1.1.1 BMSC培養(yǎng):在無菌條件下取SD大鼠股骨和脛骨，以無血清DMEM(美國Gibco BRL公司)離心洗滌2次，加入含有10%胎牛血清(美國HyClone公司)的DMEM，制成骨髓細胞懸液。計數(shù)有核細胞，以7.5×105個/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿(美國Falcon公司)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，貼壁法分離BMSCs，接種5天后首次換液。待細胞生長達到80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，以1.5×104個/cm2的密度接種，常規(guī)傳代擴增，第2代細胞用于實驗。

1.1.2 軟骨細胞培養(yǎng):在無菌環(huán)境下取SD大鼠兩側(cè)肋軟骨，剪碎成1 mm3組織塊，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA 37℃振蕩消化30min，PBS沖洗2次，再以0.2%Ⅱ型膠原酶(美國Oncogene公司) 37℃振蕩消化6～8h，過濾、離心、收集、計數(shù)，以2.5×104個/cm2的細胞密度接種于培養(yǎng)皿，體外常規(guī)培養(yǎng)與擴增，第2代細胞用于實驗。

1.2 BMSC向軟骨細胞的誘導培養(yǎng):從軟骨細胞P1開始，收集軟骨細胞上清液，0.22μm濾網(wǎng)抽濾消毒，4℃保存?zhèn)溆?。當P1 BMSC達到80%融合時，消化收集細胞，以1.5×104個/cm2細胞密度接種于培養(yǎng)皿中，其中預置載玻片，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，吸除培養(yǎng)液，加入軟骨細胞上清液進行誘導培養(yǎng)，為誘導組。直接用全培養(yǎng)液培養(yǎng)的BMSC為未誘導組。每天半量換液，誘導7天后取出玻片，用95%冷丙酮固定玻片，進行免疫組化檢測。收集培養(yǎng)皿內(nèi)的剩余細胞進行RT-PCR鑒定。

1.3 細胞接種與體內(nèi)移植:取第2代BMSCs與軟骨細胞以7: 3(BMSCs: 軟骨細胞)比例混合均勻后以5.0×107個/ml的終濃度接種于殼聚糖生物材料(直徑9mm，高3mm)上。相同終濃度 (5.0×107個/ml) 的單純軟骨細胞和單純BMSCs分別作為陽性對照組和陰性對照組。以1.5×107個/ml終濃度的少量軟骨細胞(細胞濃度相當于上述3組的30%)作為低軟骨細胞濃度對照組。各細胞-材料復合物于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)4～5h后加入加入含有10%胎牛血清(美國HyClone公司)的DMEM。體外培養(yǎng)一周后植入裸鼠皮下。

1.4 相關(guān)檢測

1.4.1 Ⅱ型膠原表達檢測:誘導7天后取出玻片，誘導組和未誘導組分別進行Ⅱ型膠原免疫組化染色，以軟骨細胞做陽性對照，以1:100稀釋的兔抗鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體、PV兩步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)顯示各組標本Ⅱ型膠原的表達情況。

1.4.2 RT-PCR鑒定:Trizol分別提取各組細胞的總mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生物工程有限公司)操作步驟逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計合成ColⅡ和aggrecan引物序列(ColⅡ上游引物5'-GTCCAGATGACTTTCCTCCGTC-3'，下游引物5'-TGTCCACACCAAATT CCTGATC-3，325 bp;aggrecan上游引物 5'-GGAATCCCT AGCTGCTTAGCAG-3，下游引物5'-GAGTCATTGGAGCGAAGGTTC-3'，458 bp )進行RT-PCR擴增，PCR條件為ColⅡ:95℃ 3 min; 95℃ 30s， 64℃ 30 sec， 72℃ 1.5 min/30 cycles; 72℃ 10 min;aggrecan:95℃ 3min; 95℃ 30s， 60℃ 30s， 72℃ 1.5 min/30 cycles; 72℃ 10 min。其產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖做凝膠電泳進行鑒定。

1.4.3 組織學檢測:標本體內(nèi)植入8周后取材，將形成的組織以10%甲醛固定24h，石蠟包埋，切片，行HE染色、Safranin O染色、Massion染色以及阿利辛蘭染色。觀察培養(yǎng)物的組織結(jié)構(gòu)，生物材料降解情況以及軟骨特異性細胞外基質(zhì)和蛋白多糖分泌情況。

1.4.4 免疫組化檢測:標本體內(nèi)植入8周后取材以正常皮膚組織為陰性對照，以1:100稀釋的抗Ⅱ型膠原單克隆抗體(鼠抗人，美國Chemicon公司)特異性結(jié)合標本中的Ⅱ型膠原，再經(jīng)生物素化的二抗(羊抗鼠，美國Chemicon公司)結(jié)合，3，3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。顯示各組標本Ⅱ型膠原的表達情況。

2結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng):BMSCs呈紡綞形或梭形，原代集落樣生長，12天后即可達到90%以上的融合狀態(tài);傳代后可形成單層，類成纖維細胞樣生長，排列具有一定的方向性(圖1)。原代細胞一般12～24h貼壁，48h后細胞開始增殖。細胞剛剛貼壁時仍為圓形，伸展后呈多角形，以類似于同源細胞群的生長方式形成獨立的小群體，中央密集處可形成軟骨樣結(jié)節(jié)。5天左右即可達到90%以上的融合狀態(tài)(圖2)。BMSC和軟骨細胞在第2代以內(nèi)均有很強的增殖能力，擴增后能夠達到體內(nèi)移植所需細胞數(shù)量。

2.2 Ⅱ型膠原表達檢測:誘導組和軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組化可見胞質(zhì)被染成棕褐色的陽性細胞(圖3A)，而未誘導組中未見Ⅱ型膠原陽性細胞(圖3B)。

2.3 RT-PCR:誘導細胞經(jīng)RT-PCR擴增后，在300～500 bp之間接近300 bp和500 bp分別可見到兩條明顯的條帶，說明經(jīng)誘導的細胞中表達Ⅱ型膠原和aggrecan的mRNA，而對照組中未見表達(圖4)。

2.4 大體觀察和組織學檢測:標本體內(nèi)植入8周后，實驗組和大量軟骨細胞對照組部位均有成熟軟骨組織形成，其外觀和彈性與正常軟骨極為相似，組織學可見標本內(nèi)存在大量成熟的軟骨陷窩。骨髓細胞組復合物只形成了少量軟組織，組織學顯示為纖維組織特征。低濃度軟骨細胞組多數(shù)標本有一定量的軟骨樣組織形成，但新生軟骨量明顯少于實驗組(圖5)。

2.5 組織化學和免疫組化檢測:阿里辛蘭染色顯示實驗組和大量軟骨細胞對照組標本細胞外基質(zhì)具有異染特性，藏紅花染色也顯示標本的基質(zhì)中含有大量的蛋白聚糖沉積(紅染基質(zhì))，與正常軟骨著色基本一致。免疫組化結(jié)果還進一步顯示實驗組標本表達II型膠原(圖6)。骨髓基質(zhì)細胞組標本無軟骨特異性基質(zhì)著色，II型膠原表達陰性。少量軟骨細胞組標本局部區(qū)域有軟骨樣基質(zhì)沉積，但著色程度顯著低實驗組，II型膠原表達也較微弱。

3討論

BMSCs來源充足，取材損傷小，體外增殖能力強，且具有軟骨分化潛能，是優(yōu)良的軟骨組織構(gòu)建種子細胞。目前促進BMSCs向軟骨定向分化的主要方法是應用生長因子進行誘導，這些方法費用昂貴并可能因生長因子應用而產(chǎn)生副作用。已有研究證實[1-3]，BMSCs在關(guān)節(jié)軟骨缺損內(nèi)能向軟骨定向分化并形成軟骨組織。本研究以此為根據(jù)，期望通過軟骨細胞與BMSCs混合接種，使軟骨細胞在皮下組織內(nèi)形成一個軟骨微環(huán)境，探討B(tài)MSCs能否在這一微環(huán)境作用下向軟骨分化并形成軟骨組織。

在前期實驗中我們將培養(yǎng)SD大鼠軟骨細胞的上清液經(jīng)0.22μm濾器過濾去除漂浮的軟骨細胞而保留細胞分泌的蛋白質(zhì)類生長因子，將上清液加入BMSC培養(yǎng)皿中7天后取出標本進行Ⅱ型膠原免疫組化檢測，顯示細胞分泌基質(zhì)中含有大量軟骨特異性的細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原成分;而RT-PCR檢測誘導前后細胞內(nèi)Ⅱ型膠原和aggrecan mRNA表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導組的Ⅱ型膠原和aggrecan mRNA表達陽性，而對照組則為陰性。進一步證實了誘導后的BMSC已向軟骨細胞轉(zhuǎn)化。

其后的實驗結(jié)果表明少量的軟骨細胞與大量的BMSCs在裸鼠體內(nèi)共培養(yǎng)，能夠形成較成熟的軟骨組織，而新生軟骨在大體外觀、組織學特征、胞外基質(zhì)染色、II 型膠原表達及GAG 含量等諸多方面均與相同細胞數(shù)量單純軟骨細胞移植形成的軟骨非常相近。這提示在少量軟骨細胞的誘導作用下，混合細胞組中大量的BMSCs可以基本取代軟骨細胞的作用在非軟骨環(huán)境中形成軟骨。更重要的是，所有結(jié)果均表明混合細胞組形成軟骨的質(zhì)與量均明顯優(yōu)于低濃度軟骨細胞組，表明BMSCs在混合組軟骨形成過程中的確發(fā)揮了重要作用，直接參與了軟骨再生。因為混合細胞組與低濃度軟骨細胞組相比，軟骨細胞數(shù)量是相近的，新生軟骨量的成倍增加顯然是由于混合組中大量BMSC的存在所致。而在單純BMSCs注射組則未見軟骨樣組織形成，表明無軟骨細胞誘導作用時，單純BMSCs不能形成軟骨組織。

已有研究表明:細胞是能夠因為周圍環(huán)境中其它細胞的影響而變化的[4-8]，軟骨細胞可以分泌多種生長因子如:轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ)、胰島素樣生長因子(IGF)等[9-10]，這些因子是公認的BMSCs向軟骨細胞分化的誘導因子，軟骨細胞分泌的這些可溶性因子可能在BMSCs軟骨形成過程中發(fā)揮了重要作用。但我們的另一項實驗表明，這些因子誘導的BMSCs注射到皮下很難形成均質(zhì)成熟的軟骨組織，說明軟骨細胞產(chǎn)生的誘導機制中可能還需要其它因素參與。有文獻報道關(guān)節(jié)軟骨細胞的培養(yǎng)液能明顯抑制血管內(nèi)皮細胞增殖[11]，而將關(guān)節(jié)軟骨細胞與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)則可加速軟骨細胞的肥大與骨化進程[12]，這說明血管化是軟骨形成的不利因素，軟骨細胞有可能會分泌某種抑制血管形成的因子阻止血管長入新生組織，從而促進了BMSCs在體內(nèi)非軟骨環(huán)境中形成軟骨。此外，軟骨的特異性細胞外基質(zhì)成分(如II型膠原、硫酸軟骨素等)及軟骨細胞膜表面某些大分子(如整合素α2、β1)等也是軟骨微環(huán)境的重要組成部分，對軟骨細胞的增殖、粘附、分化狀態(tài)維持及細胞間信號傳導等生物活動具有重要作用，但其是否參與軟骨細胞誘導BMSCs軟骨分化過程尚需進一步深入研究。

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[收稿日期]2009-11-06 [修回日期]2010-01-13

編輯/張惠娟