不同劑量雌激素對(duì)裸鼠血管瘤模型的影響

[摘要]目的:建立人毛細(xì)血管瘤裸鼠移植模型，探討血管瘤裸鼠模型建立的最佳條件。方法:將手術(shù)切除的1例雌激素受體陽(yáng)性的兒童增生期血管瘤組織制成組織塊，植入20只裸鼠(BALB/ c nude mice) 皮下，每只4 處，將20只裸鼠分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)1組在移植后給予普通鼠食喂養(yǎng);實(shí)驗(yàn)2 組在1組基礎(chǔ)上每周肌注雌二醇0.01 mg;實(shí)驗(yàn)3組在1組基礎(chǔ)上每周肌注雌二醇0.1mg;實(shí)驗(yàn)4組在1組基礎(chǔ)上每周肌注雌二醇1mg，于移植后第30、60、90天切取移植瘤。移植瘤標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)光鏡檢查，用血管內(nèi)皮細(xì)胞單克隆抗體CD31、CD34進(jìn)行免疫組化染色。 結(jié)果:移植后早期各組標(biāo)本內(nèi)皮細(xì)胞大量變性、壞死，30天后，單純喂養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)1組及實(shí)驗(yàn)2組部分移植瘤開始吸收或形成膿腫及纖維化。實(shí)驗(yàn)3、4組移植瘤開始緩慢生長(zhǎng)。90天后實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組移植瘤均未成活，實(shí)驗(yàn)4組移植瘤部分成活，而實(shí)驗(yàn)3組移植瘤全部成活。光鏡下成活的移植瘤與原血管瘤組織生物學(xué)特點(diǎn)相似。 結(jié)論:不同劑量的雌激素對(duì)血管瘤裸鼠移植模型的建立有一定影響，適量的應(yīng)用雌激素可建立穩(wěn)定的人血管瘤裸鼠移植動(dòng)物模型。該模型可以應(yīng)用到基礎(chǔ)和臨床的血管瘤研究。

[關(guān)鍵詞]血管瘤;動(dòng)物模型;裸鼠;雌激素

[中圖分類號(hào)]R732.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)02-0200-04

The effects of different estradiol dose on hemangioma model in nude mouse

MA Ge-jia1，YI Cheng-gang1， SUN Zhi-yong2，PEI Jiao-miao1，WANG Shi-ping1，XIA Wei1，GUO Shu-zhong1，YANG Li1

(1.Institute of Plastic Surgery， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， Shaanxi， China; 2. Department of Plastic Surgery， First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning， 530021， Guangxi， China)

Abstract:ObjectiveThe aim of this study was to establish the human hemangioma model in nude mice and investigate the best conditions for it. Methods Our specimen of the grafted strawberry hemangioma in proliferative phase was taken from a child patient by surgery， and made it into small pieces， then inoculated subcutaneously into 20 BALB/ c nude mice that were randomly divided into 4 groups， namely， group I (n=5) with normal diet， groupⅡ(n=5) with normal diet and 0.01mg estradiol administered intramuscularly every week additionally， groupⅢ(n=5) with normal diet and 0.1mg estradiol administered intramuscularly every week additionally， groupⅣ(n=5) with normal diet and 1mg estradiol administered intramuscularly every week additionally. The hemangioma tissues were harvested on the 30th， 60th and 90th days after graft and then subjected to histopathological examination and immunohistochemistry staining for CD31， CD34. Results In the early periods after graft， the endothelial cells of the specimens were degenerated and there were necrosis in all groups. The hemangioma tissues in groupⅠ andⅡ became absorbed or abscessed or fibrosis， however， the tissues in group Ⅲ and Ⅳ grew slowly in the first 30 days. The samples of hemangioma in groupⅠ and Ⅱwere disappeared completely， and survived partially in groupⅣ with a completely survival in groupⅢ after 90 days. The section of survived grafted hemangioma had similar biological characteristics with the original tissue under the light microscope.Conclusion The effects of different estradiol dose on hemangioma model in nude mouse were represent as quantum libet estradiol application could establish a stationary animal model of human hemangioma which have the potential to be used in foundation and clinical study on hemangioma.

Key words:hemangioma;animal model;nude mouse;estradiol

血管瘤(hemangioma) 是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，通常發(fā)病率約為0.3%～ 1%，好發(fā)于頭面頸部、四肢等體表部位[1]。Mulliken 和Glowacki[2]根據(jù)病史、瘤體生長(zhǎng)情況及內(nèi)皮細(xì)胞等特征將其分為血管瘤和血管畸形(vascular malformation)，并且根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)以及纖維細(xì)胞形成等將血管瘤分為增殖期(proliferating phase)、消退期(involuting phase)、消退后期( involuted phase) 3個(gè)階段，其中相當(dāng)一部分血管瘤可以自然消退。但其消退的機(jī)制尚不清楚，臨床難以預(yù)先判斷其是否能夠消退及其危害性。由于對(duì)血管瘤生物學(xué)特性認(rèn)識(shí)不清，尚難以發(fā)現(xiàn)其規(guī)律，因此對(duì)血管瘤的研究一直是熱點(diǎn)。為探求其生物學(xué)特性，有人設(shè)計(jì)了用裸鼠作載體，移植人體血管瘤，建立動(dòng)物模型[3]。但是如何尋找其最佳的模型建立條件，是我們所要探求的。

1材料和方法

1.1人體血管瘤標(biāo)本來源:瘤體組織標(biāo)本來源于我科1 例近期瘤體生長(zhǎng)迅速的5個(gè)月女性患兒手腕部的增生期血管瘤。病理學(xué)檢查光鏡下見腫瘤組織位于真皮層內(nèi)，無明顯包膜，由大小不等的變形毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其形成的管腔構(gòu)成，腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，局部有的內(nèi)皮細(xì)胞成團(tuán)，尚無管腔形成。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng):裸鼠(BALB/c nude mice) 20 只，雌雄不限，鼠齡20～24天，體重18～21g，隨機(jī)分成4組，每組5 只，一組為單純接種組，剩下3組為雌激素作用組。實(shí)驗(yàn)1組在移植后給予普通鼠食喂養(yǎng);實(shí)驗(yàn)2組在1組基礎(chǔ)上每周肌肉內(nèi)注射雌二醇(SIGMA，美國(guó))1次，每次0.01 mg，共12次;實(shí)驗(yàn)3組在1組基礎(chǔ)上每周肌肉內(nèi)注射雌二醇1次，每次0.1 mg，共12次;實(shí)驗(yàn)4組在1組基礎(chǔ)上每周肌肉內(nèi)注射雌二醇1次，每次1mg，共12次。每只動(dòng)物均獨(dú)籠飼養(yǎng)，普通鼠食喂養(yǎng)。裸鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供及飼養(yǎng)。

1.3動(dòng)物模型的建立:在無菌條件下手術(shù)切除患兒血管瘤組織，切成4mm×3mm×3mm 的小塊，用PBS液漂洗3次，分別經(jīng)皮膚切口置入所有實(shí)驗(yàn)裸鼠頸部?jī)蓚?cè)及左側(cè)臀部皮下和右側(cè)腹股溝處，每只4 處。移植工作在標(biāo)本離體后1h內(nèi)完成。

1.4腫瘤的生長(zhǎng)觀察及測(cè)量:每周定期觀察裸鼠及移植瘤生長(zhǎng)情況。于接種后15天、30天、60天、90天分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑a 及橫徑b，根據(jù)公式V =π/6×a×b2粗略估算腫瘤體積變化。

1.5病理組織學(xué)觀察及免疫組化檢測(cè):各組實(shí)驗(yàn)鼠均于移植后第30、60、90天切取移植瘤。HE染色，光鏡觀察。以裸鼠肌肉組織切片的CD31、CD34標(biāo)記為陰性對(duì)照，行移植瘤切片免疫組化的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)瘤組織CD31、CD34的陽(yáng)性指數(shù)。每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，其總數(shù)除以10，再乘100%，即為其陽(yáng)性指數(shù)。CD31、CD34由西安壯志生物技術(shù)有限公司提供(abcam，英國(guó))。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS12.0(SPSS Inc. Chicago， Illinois)統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用方差分析，P﹤0.05，有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 裸鼠及移植瘤的生長(zhǎng)特點(diǎn):飼養(yǎng)90天，所有裸鼠均存活。實(shí)驗(yàn)1組(單純瘤體移植組)1個(gè)月后所有移植瘤組織體積都不同程度地變小，到90天時(shí)有9處完全吸收消失，其余11處均不同程度地變小、硬化、消退。實(shí)驗(yàn)2組(低劑量0.01mg組)植入后瘤體也有不同程度的變小，90天后也有部分變小、消退。實(shí)驗(yàn)3組(0.1mg組)與實(shí)驗(yàn)4組(1mg組)1個(gè)月后都有增大，但是實(shí)驗(yàn)4組有部分瘤體增長(zhǎng)速度過快而發(fā)生潰破，最終纖維化，消失。實(shí)驗(yàn)3組瘤體穩(wěn)定的逐漸變大。(表1，圖1)

2.2 光鏡下瘤體病理學(xué)檢查:移植后30天，實(shí)驗(yàn)1組已可見少量纖維組織和吞噬細(xì)胞，部分纖維組織分隔瘤組織成小葉狀，可見間質(zhì)細(xì)胞。其余三組可見含有較多單層細(xì)胞的毛細(xì)血管腔。移植60天后，實(shí)驗(yàn)1組已無明顯的血管腔樣結(jié)構(gòu)，多被纖維結(jié)締組織和脂肪組織替代;實(shí)驗(yàn)2組也可見纖維結(jié)締組織和脂肪組織。其余兩組可見增生活躍的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞體積不規(guī)則，形成較多含單層內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管腔和血竇。但實(shí)驗(yàn)4組，既1mg組，部分瘤體增殖過快，發(fā)生潰破;其余瘤體內(nèi)皮細(xì)胞增殖活躍，有血竇樣結(jié)構(gòu)生成，內(nèi)含大量紅細(xì)胞。移植90天后，實(shí)驗(yàn)1、2組大部分瘤體消失，剩余全部纖維化。實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞間質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞都增多，毛細(xì)血管管腔密集，有大量血竇生成，內(nèi)可見紅細(xì)胞(圖2)。實(shí)驗(yàn)4組部分潰瘍后遺留纖維結(jié)締組織，其余瘤體情況同實(shí)驗(yàn)3組。

2.3移植瘤免疫組化檢測(cè)

2.3.1CD31在30天時(shí)，在各組都有陽(yáng)性表達(dá)。60天時(shí)，實(shí)驗(yàn)1組與2組表達(dá)率下降，實(shí)驗(yàn)3組與4組表達(dá)率升高。90天時(shí)，實(shí)驗(yàn)1組無瘤組織，實(shí)驗(yàn)2組殘留組織幾乎沒有表達(dá);實(shí)驗(yàn)3組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)依然很高，實(shí)驗(yàn)4組剩余瘤組織陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)同樣較高。作為對(duì)照的裸鼠肌肉組織CD31表達(dá)為陰性。(表2，圖3)

2.3.230天時(shí)CD34在各組都有明顯的表達(dá)。60天后實(shí)驗(yàn)1組和2組表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯下降，實(shí)驗(yàn)3組和實(shí)驗(yàn)4組中正常瘤組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)升高。90天時(shí)實(shí)驗(yàn)1組已無瘤組織，實(shí)驗(yàn)2組剩余瘤組織表達(dá)很低;實(shí)驗(yàn)3組仍然呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)4組剩余瘤組織也有較強(qiáng)表達(dá)。(表3，圖4)

3討論

人們很早就觀察到皮膚血管瘤的生長(zhǎng)與雌激素水平有關(guān)，近期研究發(fā)現(xiàn)增殖期血管瘤中雌激素和雌激素受體(ER)都比消退期要高很多[4-5]。Sasaki 等[6]發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒增殖期血管瘤患兒血漿雌二醇水平較正常同齡兒高出4倍，且瘤組織中ER 顯著高于正常皮膚血管組織。Khalid等[7]用免疫組化法證實(shí)增生的毛細(xì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤血管組織中雌激素受體相關(guān)抗原ER-D5表達(dá)增高。此后，一些學(xué)者就血管瘤中ER的表達(dá)做了免疫組化研究。目前認(rèn)為，血管瘤是雌激素的靶組織之一，雌激素和ER在血管瘤的發(fā)生發(fā)展中可能產(chǎn)生某種重要作用[8-9]。大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌激素與一些腫瘤的血管生成密切相關(guān)，并且其促血管生成作用主要通過上調(diào)VEGF、bFGF 的表達(dá)，使兩者協(xié)同來實(shí)現(xiàn)[10]。如乳癌、子宮內(nèi)膜異位癥中，雌激素能通過上調(diào)VEGF 基因的表達(dá)增強(qiáng)其血管生成作用[11-14]。Hyder等[15]發(fā)現(xiàn)，VEGF基因上有2個(gè)核苷酸序列與ER 基因中的雌激素反應(yīng)元件高度同源，分別位于VEGF基因的5'和3'非翻譯區(qū)，這2個(gè)序列可與ER 特異地結(jié)合，雌激素即可與ER結(jié)合影響VEGF的表達(dá)。雌激素作為一種促有絲分裂原，能與胞核內(nèi)的ER結(jié)合，發(fā)生構(gòu)象改變，作用于轉(zhuǎn)錄輔助因子，導(dǎo)致特異性基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，促進(jìn)細(xì)胞DNA、RNA 和蛋白質(zhì)合成，刺激細(xì)胞分裂增殖[16-17]。但雌激素在血管瘤生長(zhǎng)機(jī)制中所起的作用一直不明，有的學(xué)者認(rèn)為雌二醇在有細(xì)胞生長(zhǎng)因子(如血管內(nèi)皮因子，或纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)共同存在的條件下，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞繁殖有促進(jìn)作用[18]，但作用機(jī)制尚不明確。

目前對(duì)血管瘤的研究，大部分是建立在對(duì)離體人血管瘤標(biāo)本的研究基礎(chǔ)上。近年來，隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的發(fā)展，逐步建立起各種血管瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。有的是利用動(dòng)物身體上某一特殊部位與毛細(xì)血管形態(tài)和結(jié)構(gòu)的相似性來進(jìn)行研究。應(yīng)用最多的是利用雞的雞冠和肉垂。有的是利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝、脾組織存在大量血竇和內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)，作為海綿狀血管瘤的動(dòng)物模型。有學(xué)者[19]應(yīng)用DNA顯微注射法，將 Py-MT基因?qū)胄∈笫芫眩⒅踩肽甘筝斅压?。結(jié)果在62只新生小鼠中得到1只具有血管瘤樣表型的小鼠。該小鼠的唇、舌、掌心、皮膚及胃黏膜表面均可見有血管樣異常增生物。增生物經(jīng)組織學(xué)檢查為一些有扁平細(xì)胞襯里的充滿血的海綿狀囊腔結(jié)構(gòu)，類似于海綿狀血管瘤的組織學(xué)表現(xiàn)。還有利用細(xì)胞懸液接種的辦法制作血管瘤裸鼠模型[20]等。研究表明，雌激素可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血管床明顯充血，促進(jìn)移植物毛細(xì)血管及營(yíng)養(yǎng)血管的形成。體內(nèi)高水平的雌激素可能通過相應(yīng)受體刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的充血，來影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[21]。同時(shí)，雌激素也可以直接作用于血管，使微血管擴(kuò)張，血管床容量增加，從而促進(jìn)移植瘤的成活。

研究人血管瘤的機(jī)制和防治方法，我們需要所用模型中血管瘤生長(zhǎng)特點(diǎn)與人體血管瘤的自然生長(zhǎng)過程相似，腫瘤表達(dá)穩(wěn)定移植瘤在動(dòng)物體內(nèi)可持續(xù)繁殖和存活，移植瘤的形態(tài)、功能與原人體腫瘤保持一致及移植瘤來源于人體而非動(dòng)物自身的誘發(fā)瘤。研究發(fā)現(xiàn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)多種特異性的內(nèi)皮標(biāo)志，如 CD31、CD34、VWF等[22-23]。其中CD31、CD34是微小血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，在毛細(xì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中為高表達(dá)。我們用鼠抗人的CD31、CD34單克隆抗體檢測(cè)移植后血管瘤組織，結(jié)果增殖的移植瘤中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(檢測(cè)移植前的原供體血管瘤組織，也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá))，而消退的組織中表達(dá)明顯下降，而在作為陰性對(duì)照的裸鼠肌肉組織表達(dá)為陰性，證明其內(nèi)皮細(xì)胞來源是人而不是裸鼠。

我們?cè)谂韽?qiáng)等[3]人血管瘤動(dòng)物模型的建立方法的基礎(chǔ)上，探尋最佳的雌激素用量，探討血管瘤裸鼠模型建立的最佳條件。試驗(yàn)中使用雌激素后我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于未使用雌激素的移植物增殖迅速，但是移植物的增殖對(duì)于雌激素的劑量還是存在依賴性，不使用或使用雌激素劑量過低不能夠有效的維持移植物的增殖;早期各組移植物內(nèi)皮細(xì)胞都有壞死和凋亡的情況， 30天后，無雌激素和低劑量雌激素組可以觀察到移植物中有大量的纖維結(jié)締組織增生，血管內(nèi)皮和血管管腔樣結(jié)構(gòu)消失，血管閉塞，同時(shí)還有大量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD31、CD34陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。其它兩組內(nèi)皮細(xì)胞在壞死和凋亡后又迅速的增殖，出現(xiàn)大量無規(guī)則的紊亂的內(nèi)皮細(xì)胞和管腔樣結(jié)構(gòu)，還可見有血竇樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)充斥有紅細(xì)胞;CD31、CD34免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞大量增生，有成團(tuán)聚集的傾向。但同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)如果雌激素用量過大，會(huì)出現(xiàn)部分瘤體生長(zhǎng)迅速并發(fā)生潰破、壞死;在1mg組(既實(shí)驗(yàn)4組)觀察到壞死的移植物潰破到表皮形成潰瘍樣的結(jié)構(gòu)。我們認(rèn)為是由于過量雌激素刺激使移植物增殖過快，而血供難以跟上而發(fā)生移植物的壞死。在制作模型過程中適當(dāng)?shù)膽?yīng)用雌激素，可以維持并且促進(jìn)移植物的生長(zhǎng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管管腔樣結(jié)構(gòu)也增多，有血竇樣結(jié)構(gòu)生成，內(nèi)可見有紅細(xì)胞聚集;免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示CD31、CD34陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞明顯增多。其生物學(xué)特性和患者的增殖期血管瘤的生物學(xué)特性相似，我們可以用該模型來研究血管瘤的防治和機(jī)理。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步摸索了裸鼠血管瘤移植模型制作的最佳條件。在適當(dāng)?shù)耐鈦泶萍に氐母深A(yù)下，移植腫瘤表達(dá)穩(wěn)定，有增殖性，同時(shí)載瘤小鼠生長(zhǎng)良好。而建立的移植瘤模型能夠存在足夠的時(shí)間，為進(jìn)一步研究血管瘤的生物學(xué)特點(diǎn)及其生長(zhǎng)轉(zhuǎn)歸機(jī)制，以及利用它進(jìn)行血管瘤防治的臨床研究提供了很好的條件。

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[收稿日期]2009-10-26[修回日期]2010-01-12

編輯/張惠娟