凍干法保存脫細(xì)胞組織工程血管支架的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的:探討冷凍干燥技術(shù)長(zhǎng)期保存脫細(xì)胞組織工程血管支架材料的可行性。方法:將制備的脫細(xì)胞組織工程血管支架預(yù)冷后置入-70℃、6.67×10-4kPa的冷凍干燥機(jī)內(nèi)6 h作冷凍干燥處理。通過對(duì)冷凍干燥處理前后脫細(xì)胞血管支架材料的組織，超微結(jié)構(gòu)觀察、生物力學(xué)評(píng)估、細(xì)胞毒性測(cè)定以及動(dòng)物體內(nèi)的組織相容性檢測(cè)，研究冷凍干燥處理對(duì)脫細(xì)胞血管支架材料生物相容性和生物力學(xué)特性的影響。結(jié)果:冷凍干燥處理對(duì)于脫細(xì)胞血管材料的生物力學(xué)及生物化學(xué)特性沒有明顯影響，處理后的材料依然具有良好的體內(nèi)、外生物相容性。結(jié)論:冷凍干燥處理作為脫細(xì)胞組織工程血管支架材料的長(zhǎng)期儲(chǔ)存方法是可行的。

[關(guān)鍵詞]組織工程血管;脫細(xì)胞組織工程血管支架;冷凍干燥

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)02-0218-04

Conservation of the tissue-engineered acellular vascular scaffold with freezing and drying technique

LIU Bin1， ZHANG Man-jing2， XIA Wei1， LU Kai-hua1，GUO Shu-zhong1

(Department of Plastic Surgery， Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032， Shaanxi，China 2.Department of Platic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College)

Abstract: ObjectiveTo investigate the feasibility of a freeze-drying technique preservation protocol on the acellular vascular scaffold.MethodsAcellular vascular scaffolds were treated by freezing and drying technique at -70℃(6.67×10-4kPa) for 6h，then appraised the scaffolds by histological and ultrastructural observation and evaluated its biocompatibility and biomechanics.ResultsIt was shown that the main performance indexes of the freeze-drying treated acellular scaffolds changed unremarkably in compared with the untreated ones.ConclusionFreeze-drying technique can be a good preservation protocol for tissue-engineered acellular vascular scaffold.

Key words: tissue engineering blood vessels; tissue engineered acellular vascular scaffold; freeze drying

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，組織工程學(xué)的興起為從根本上解決血管移植物替代這一問題帶來了新的曙光。組織工程血管是組織工程學(xué)領(lǐng)域的產(chǎn)物之一，是一種新的有望徹底解決小口徑人工血管移植問題的方法。脫細(xì)胞血管基質(zhì)因其具有取材方便、低免疫源性、機(jī)械性能良好等優(yōu)良特性，在血管組織工程研究領(lǐng)域中得到了越來越廣泛的應(yīng)用[1-2]， 成為該領(lǐng)域支架材料研究方面的一個(gè)熱點(diǎn)。通過前期的系列試驗(yàn)研究，我們初步摸索出一種脫細(xì)胞血管支架快速制備、消毒及結(jié)構(gòu)疏松化的方法。然而脫細(xì)胞血管材料制備后如何長(zhǎng)期保存又是一個(gè)需要面臨和解決的問題，因此我們希望找到一種簡(jiǎn)單可行的儲(chǔ)存技術(shù)來長(zhǎng)期保存制備的脫細(xì)胞血管支架以達(dá)到臨床和科研上 “隨用隨取”的目的。

在本實(shí)驗(yàn)研究中我們使用冷凍干燥技術(shù)處理制備的脫細(xì)胞血管支架，通過對(duì)處理后的支架材料進(jìn)行組織，超微結(jié)構(gòu)觀察、生物力學(xué)評(píng)估、細(xì)胞毒性測(cè)定以及動(dòng)物體內(nèi)的組織相容性檢測(cè)，研究冷凍干燥處理對(duì)脫細(xì)胞血管支架材料生物相容性和生物力學(xué)特性的影響，從而進(jìn)一步評(píng)估冷凍干燥技術(shù)作為該材料長(zhǎng)期儲(chǔ)存方法的可行性。

1材料和方法

1.1血管材料準(zhǔn)備及脫細(xì)胞血管支架的制備:選取8～12月，體重在2～2.5kg的健康雄性大耳白兔20只，在麻醉、相對(duì)無菌條件下，取出兔股動(dòng)脈，置于4℃含青霉素和鏈霉素各180mg/L的無菌PBS液中，熱缺血時(shí)間不超過15min。無菌PBS液沖洗數(shù)次去除血液雜質(zhì)，銳性去除附屬結(jié)締組織和脂肪成分以及大部分血管外膜。截取長(zhǎng)度為5cm、無明顯分支、內(nèi)徑約3mm的動(dòng)脈40根作為實(shí)驗(yàn)材料。將所取得的30根血管材料反復(fù)凍融加超高壓處理后，置人含有15μg/ml RNase A，150μg/ml DNase I (Sigma)溶液中，沖洗48h(37℃，5%CO2環(huán)境內(nèi)攪拌)，然后用PBS洗滌1天。

1.2脫細(xì)胞血管支架的凍干處理:取20根制備好的脫細(xì)胞血管支架材料，根據(jù)血管材料口徑和長(zhǎng)度套入相應(yīng)的玻璃棒上，于普通冰箱冷凍室內(nèi)-4℃預(yù)冷24～48 h，然后在-80℃低溫冰箱中速凍24h，再置入-70℃、6.67×10-4 kPa的干燥冷凍機(jī)(LGJ-10C，上海)內(nèi)6h作冷凍干燥處理。用包裝袋封裝后，置常溫下保存待用，并注明凍干日期、血管種類、長(zhǎng)度及口徑，保存8周以上后使用。使用時(shí)，將血管材料由包裝袋中取出，浸泡于生理鹽水中復(fù)溫約10min，血管變軟后由玻璃棒上輕輕取下，以0.1%過氧乙酸溶液消毒。

1.3組織學(xué)觀察

1.3.1 光學(xué)顯微鏡:4%多聚甲醛分別固定經(jīng)凍干-復(fù)水處理及經(jīng)未凍干處理的脫細(xì)胞血管支架標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋切片，行蘇木精伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.2 掃描電鏡:3%戊二醛分別預(yù)固定經(jīng)凍干-復(fù)水處理及經(jīng)未凍干處理的脫細(xì)胞血管支架標(biāo)本，4℃儲(chǔ)存送檢。標(biāo)本在S-3400N型掃描電鏡下觀察。

1.4 兔血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng):無菌條件下取出兔胸主動(dòng)脈。去除附壁血細(xì)胞，剪除外膜多余脂肪和筋膜。分別注入0.125%、0.25%胰酶和0.1%膠原酶消化液，使管腔充盈，37℃作用15、12、17min，松開一端，收集消化液; 注入含10%胎牛血清 M199培養(yǎng)液再次沖洗管腔;將消化液和沖洗液并800r/min，5min離心，棄上清;加M199培養(yǎng)液，吹打均勻制成細(xì)胞懸液，以2×105/瓶濃度，傳入25cm2培養(yǎng)瓶;37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每24h半定量換液;當(dāng)原代培養(yǎng)至融合形成致密的單層細(xì)胞時(shí)即可傳代，實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞為第3～7代細(xì)胞。

1.5 接觸細(xì)胞毒性測(cè)定:實(shí)驗(yàn)組將約3mm2 的無菌醫(yī)用粘合膜粘貼于一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，無菌條件下取5mm×5mm大小凍干處理后脫細(xì)胞血管基質(zhì)，黏附于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。作為陽性對(duì)照組，將一滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培養(yǎng)皿中央的脫細(xì)胞血管基質(zhì)上;陰性對(duì)照組，培養(yǎng)皿中央醫(yī)用粘合膜粘貼未經(jīng)凍干處理的脫細(xì)胞血管基質(zhì)。將準(zhǔn)備的內(nèi)皮細(xì)胞懸液依次接種于上述培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)孵育48h后倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞與培養(yǎng)皿中央材料毗鄰部位的形態(tài)。

1.6羥脯氨酸含量測(cè)定:利用羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(南京建成)及多功能光度計(jì)分別測(cè)定分別測(cè)定新鮮血管及凍干處理前后脫細(xì)胞血管支架材料羥脯氨酸含量的變化。

1.7 處理前后材料的機(jī)械力學(xué)特性的測(cè)定:將新鮮血管及凍干處理前后脫細(xì)胞血管支架材料在INSTRUIN 1122生物力學(xué)測(cè)試系統(tǒng)(Instron Uo.USA)下行單軸拉伸試驗(yàn)，測(cè)定最終抗張強(qiáng)度和縫合強(qiáng)度。

1.8 血管支架材料凍干-復(fù)水處理后體內(nèi)生物相容性的初步研究:大耳白兔以戊巴比妥鈉(30～40mg/kg，iv)麻醉，取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部?jī)蓚?cè)去毛，碘伏消毒，鋪巾。在腹部?jī)蓚?cè)各做2個(gè)切口，長(zhǎng)約1cm，切開皮膚全層后以眼科剪仔細(xì)分離皮下形成一腔隙。把脫細(xì)胞血管基質(zhì)及經(jīng)凍干-復(fù)水處理的脫細(xì)胞血管基質(zhì)分別植入皮下腔隙中，每側(cè)植入2塊材料，鋪平，縫合切口，再次以碘伏消毒切口。無壓力包扎，飼養(yǎng)。觀察兔全身及材料種植局部反應(yīng)，并分別于術(shù)后7天、14天、21天及28天取出標(biāo)本，4%多聚甲醛分別固定血管支架標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋切片，行蘇木精伊紅 (HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，結(jié)果以均數(shù)x±s表示， 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析比較， P <0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 大體形態(tài):脫細(xì)胞處理組管壁變軟塌陷，但彈性良好(圖1);經(jīng)過冷凍干燥保存處理后的脫細(xì)胞血管支架形成特有的海綿狀多孔性結(jié)構(gòu)(圖2);復(fù)水后脫細(xì)胞血管支架形態(tài)及大體結(jié)構(gòu)完全復(fù)原(圖3)。

2.1.2 經(jīng)凍干處理脫細(xì)胞血管基質(zhì)的組織學(xué)觀察:經(jīng)過冷凍干燥處理后的脫細(xì)胞血管支架，其管壁膠原纖維波浪狀結(jié)構(gòu)均保存基本完好，同未經(jīng)冷凍干燥處理的脫細(xì)胞血管支架相比，結(jié)構(gòu)無明顯差異(圖4、5)。

2.1.3 超微結(jié)構(gòu)觀察:經(jīng)過冷凍干燥處理后的脫細(xì)胞血管支架結(jié)構(gòu)較未處理前略疏松，但整體結(jié)構(gòu)保持完好(圖6、7)。

2.2 接觸性材料細(xì)胞毒性:凍干處理前后的脫細(xì)胞血管材料均無細(xì)胞毒性，在材料的周圍未發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的接觸或者生長(zhǎng)抑制，測(cè)試樣本周圍的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常，共培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖旺盛(圖8、9)。

2.3 正常血管與凍干處理后脫細(xì)胞血管基質(zhì)的膠原含量的測(cè)定:血管材料的羥脯氨酸含量各組兩兩相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即血管材料在上述各處理?xiàng)l件組中，其羥脯氨酸含量(膠原含量)與凍干處理前相比無明顯變化，見表1。

2.4 材料的機(jī)械力學(xué)特征:血管材料的最終抗張強(qiáng)度與縫線保留強(qiáng)度各組兩兩相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即血管材料在上述各處理?xiàng)l件組中基本力學(xué)特征在經(jīng)凍干處理前后無明顯變化，見表2。

2.5經(jīng)過凍干處理后血管支架材料體內(nèi)生物相容性

2.5.1 術(shù)區(qū)情況及植入材料大體外觀:家兔腹部皮下埋植凍干處理脫細(xì)胞血管支架后，精神、食欲均良好。手術(shù)區(qū)術(shù)后第2天或第3天出現(xiàn)輕微紅腫，術(shù)后第4天到第5天消退，埋植處高出周圍皮面。切口均愈合良好，術(shù)后7天拆線。未發(fā)現(xiàn)明顯紅腫，無膿性分泌物等情況。手術(shù)后埋植脫細(xì)胞血管支架而隆起的高度隨時(shí)間的推移逐漸降低，到術(shù)后3周時(shí)已基本與周圍皮膚一致。

大體觀察:1周組材料體外可觸及、輪廓清晰、質(zhì)地中、血管浸潤(rùn)明顯、纖維包膜可與材料分離(圖10)。3周組材料外周包膜變薄，與支架材料結(jié)合緊密，材料表面有降解吸收現(xiàn)象，失去網(wǎng)狀狀結(jié)構(gòu)。4周組材料幾乎完全被吸收，材料周圍組織無明顯壞死及感染。

2.5.2 植入材料組織學(xué)檢查:2周組未經(jīng)凍干處理的脫細(xì)胞血管基質(zhì)及經(jīng)凍干處理的脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料HE染色鏡下僅見少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖11、12)。3周后炎細(xì)胞數(shù)明顯下降，與其下組織分界不清，包膜和材料中有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并伴增生的成纖維細(xì)胞。4周組材料進(jìn)一步吸收變薄，呈稀疏的線條狀，浸潤(rùn)炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。兩組材料體內(nèi)反應(yīng)過程基本相同，各組均未見組織壞死。植入材料大體外觀及組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，脫細(xì)胞血管基質(zhì)在凍干處理前后具有良好的體內(nèi)生物相容性。

3討論

傳統(tǒng)生物材料的保存方法主要有深低溫凍存和冷凍干燥保存兩種。對(duì)于凍干保存生物材料的生物學(xué)特性的研究國(guó)內(nèi)外已不少見，但多集中在眼角膜、骨骼及皮膚等片狀材料方面。對(duì)于脫細(xì)胞血管基質(zhì)支架此類管狀生物材料的生物力學(xué)和化學(xué)特性影響的研究，國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此在我們的研究中將冷凍干燥技術(shù)應(yīng)用到脫細(xì)胞血管支架此類管狀生物材料的保存處理中， 以評(píng)估凍干技術(shù)作為脫細(xì)胞血管支架材料長(zhǎng)期保存方法的可行性。

真空冷凍干燥技術(shù)是將真空技術(shù)、冷凍技術(shù)和干燥技術(shù)結(jié)合起來的一種綜合性技術(shù)。其最先應(yīng)用于血漿、血清、酶制劑、生物細(xì)胞、人體組織等生物制品和材料的凍干保存。早期的研究發(fā)現(xiàn)，部分蛋白制品通過冷凍干燥技術(shù)處理后的真空包裝可以達(dá)到在室溫下保存兩年甚至更長(zhǎng)時(shí)間而不發(fā)生變質(zhì)的良好效果[4]，從最早應(yīng)用于處理生物學(xué)材料[5]，后歷經(jīng)應(yīng)用氟利昂-12改良處理法[6]，直到今天使用凍干同種異體骨成功修復(fù)牙周骨缺損[7]， 利用凍干技術(shù)制備多孔的組織工程支架材料[8]。凍干技術(shù)在組織保存及材料制備方面的研究走過了近六十年的發(fā)展歷程。

冷凍干燥處理對(duì)于脫細(xì)胞血管材料的生物學(xué)特性的影響是本試驗(yàn)中主要的考察指標(biāo)。主要包括材料的細(xì)胞毒性、生物力學(xué)以及生物相容性等。在我們的研究中，對(duì)經(jīng)冷凍干燥保存處理的脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的上述指標(biāo)進(jìn)行了體外和體內(nèi)的測(cè)試。通過體外試驗(yàn)，我們利用兔的血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)經(jīng)冷凍干燥處理并保存后的脫細(xì)胞血管支架的接觸細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):經(jīng)過凍干保存處理的脫細(xì)胞血管基質(zhì)其材料毒性并未增加，材料周圍未內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)正常且未發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的接觸或者生長(zhǎng)抑制。由此我們可以得出:經(jīng)過冷凍干燥處理并保存的脫細(xì)胞血管基質(zhì)在體外具有良好的細(xì)胞生物相容性。另外在體內(nèi)試驗(yàn)中，我們?cè)谕酶共科は侣裰裁摷?xì)胞血管支架，通過對(duì)不同時(shí)間段取材的組織及形態(tài)學(xué)分析，初步證實(shí)了冷凍干燥處理前后，脫細(xì)胞血管支架材料都具有良好的體內(nèi)生物相容性。

脫細(xì)胞血管基質(zhì)的主要成分為膠原纖維，而膠原纖維的主要分解產(chǎn)物為羥脯胺酸。因此我們的實(shí)驗(yàn)中通過測(cè)定凍干保存處理前后材料羥脯胺酸的含量，來判斷上述處理是否會(huì)破壞支架材料的膠原結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)凍干保存處理前后的脫細(xì)胞血管支架其羥脯胺酸含量基本一致，從而證明凍干保存處理對(duì)于脫細(xì)胞血管支架的膠原結(jié)構(gòu)無明顯影響。

足夠的初始強(qiáng)度和彈性對(duì)于組織工程血管支架的材料來說是非常重要和必需的。因此，我們?cè)谠囼?yàn)中測(cè)試了凍干保存處理前后血管組織的強(qiáng)度和彈性，以判斷凍干處理對(duì)于脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的主要生物力學(xué)指標(biāo)的影響。體外測(cè)試的結(jié)果證實(shí)經(jīng)過凍干保存的脫細(xì)胞血管支架其強(qiáng)度和彈性雖然出現(xiàn)了輕度的降低，但是這種改變不具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究通過對(duì)凍干保存處理前后脫細(xì)胞血管支架材料生物化學(xué)與生物力學(xué)特性的檢測(cè)分析，初步證明:經(jīng)過凍干保存處理的脫細(xì)胞血管材料，其細(xì)胞毒性、生物力學(xué)特征以及膠原結(jié)構(gòu)與未經(jīng)處理前相比沒有明顯的差異，凍干保存后的材料依然具有良好的生物相容性。因此我們認(rèn)為:冷凍干燥處理作為組織工程脫細(xì)胞血管支架此類管狀生物材料的長(zhǎng)期儲(chǔ)存方法是可行的。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Teebken OE，Pichlmaier AM，Haverich A. Cell seeded decellularised allogeneic matrix grafts and biodegradable polydioxanone-prostheses compared with arterial autografts in a porcine model [J]. Eur J Vasc Endovasc Surg，2001，25(22):129-139.

[2]Cho SW，Park HJ， Ryu JH，et al. Vascular patches tissue-engineered with autologous bone marrow-derived cells and decellularized tissue matrices[J]. Biomaterials，2005，26(14):1915-1921.

[3]Sewell WH， Koth DR， Pate JW， et al. Review of some experiments with freeze -dried grafts[J]. Am J Surg，1956，91(3):358-361.

[4]Smith AU. Freezing and drying biological materials[J].Nature，1958，181 (4625):1694-1696.

[5]Briggs A. A new freeze-drying technique for processing biological materials [J]. Dev Biol Stand，1976，36:251-260.

[6]Hanes PJ. Bone replacement grafts for the treatment of periodontal intrabony defects [J]. Oral Maxillofac Surg Clin North Am，2007，19 (4):499-512.

[7]Shinichi Ha，Akira Ta. Fabrication of highly porous keratin sponges by freeze-drying in the presence of calcium alginate beads[J]. Materials Science and Engineering，2008，1250-1254.

[收稿日期]2009-09-16 [修回日期]2009-12-30

編輯/張惠娟