雄激素對去勢大鼠弓狀核AR蛋白表達(dá)的影響

田光明 范光麗

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023) (西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

雄激素對去勢大鼠弓狀核AR蛋白表達(dá)的影響

田光明 范光麗

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023) (西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

為了探討雄激素(androgen)對去勢大鼠弓狀核(ARC)內(nèi)雄激素受體(AR)表達(dá)的影響。將30只3月齡雄性健康SD大鼠隨機(jī)分為GM組(睪丸摘除組)、IMC組(假手術(shù)組)、GM+T組(睪丸摘除并用睪酮替代組)，注射雄激素4周后灌注取材。結(jié)果表明，睪丸摘除組大鼠弓狀核內(nèi)AR蛋白的表達(dá)顯著減少，睪丸摘除并用睪酮替代組大鼠弓狀核內(nèi)AR蛋白的表達(dá)接近正常水平。說明去睪丸大鼠由于缺乏內(nèi)源性雄激素,引起弓狀核內(nèi)AR蛋白表達(dá)減少,而補(bǔ)充外源性雄激素可抑制這一變化。

去勢；雄激素受體；雄激素；弓狀核

雄激素是雄性體內(nèi)的一種重要激素，在雄性個體發(fā)生、生長發(fā)育和生殖功能的各個方面都起著必不可缺的作用，如誘導(dǎo)性分化、第二性征的形成和維持、精子發(fā)生的起始與維持、垂體激素分泌的反饋調(diào)節(jié)等。雄激素主要是指睪丸Leydig細(xì)胞合成、分泌的睪酮(T)及其在靶細(xì)胞內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物—雙氫睪酮(DHT)。雄激素(androgen)在調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸的神經(jīng)內(nèi)分泌活動以及影響其他腦區(qū)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能中均起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。雄激素作用的發(fā)揮是通過雄激素受體(Androgen receptors, AR)來實(shí)現(xiàn)的[2]。

弓狀核(ARC)又稱漏斗核，位于下丘腦內(nèi)側(cè)基底部第三腦室兩側(cè)與正中隆起背側(cè)部，在冠狀切面呈弓形[3]。弓狀核為下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌的重要核團(tuán)，和室旁核的小神經(jīng)分泌細(xì)胞共同發(fā)出結(jié)節(jié)漏斗束，纖維終于垂體門脈系統(tǒng)的血竇，輸送釋放激素至垂體前葉，以調(diào)控前葉激素的合成與釋放。在功能上，弓狀核成為調(diào)節(jié)下丘腦激素分泌的閘門系統(tǒng)，它可把神經(jīng)信息轉(zhuǎn)換為內(nèi)分泌信息作用于靶器官[4]。

本研究采用去勢法建立阻斷內(nèi)源性雄激素大鼠模型，通過注射外源性睪酮，檢測其對弓狀核AR蛋白表達(dá)的影響，以期為闡明雄激素和雄激素受體在SD大鼠弓狀核表達(dá)提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與動物模型的建立

3月齡雄性健康SD大鼠(購于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)30只。隨機(jī)分為睪丸摘除組(GM組)、假手術(shù)組(IMC組)和睪丸摘除并用睪酮替代組(GM+T組)。每組10只，大鼠用水合氯醛腹腔麻醉，IMC組做假手術(shù)(只切開睪丸皮膚和縱隔,不切除睪丸)，GM組和GM+T組摘除雙側(cè)睪丸，GM+T組自手術(shù)1周后開始，隔天皮下注射300 μg/mL睪酮(Testosterone)，每只0.1 mL，連續(xù)注射4周。

1.2 標(biāo)本采集及組織切片的制備

4周后，各組大鼠用水合氯醛腹腔麻醉、手術(shù)暴露胸腔、主動脈插管、100 mL生理鹽水沖凈血液后,用200 mL 4%多聚甲醛灌注固定。取下丘腦，于相同的固定液中固定12～36 h，浸入4 ℃ 200 g/L蔗糖PB液(pH7.4)中至組織沉底，將組織于開放式冰凍切片機(jī)上做連續(xù)冠狀切片，切片厚30 μm。

1.3 大鼠弓狀核中AR蛋白的檢測

免疫組化染色程序按照試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn))說明進(jìn)行，第一抗體AR多克隆抗體(武漢博士德公司生產(chǎn))的工作濃度為1∶150 (體積比)，同時設(shè)陰性對照組，組織切片用硫酸鎳銨增強(qiáng)的DAB(Sigma公司生產(chǎn))呈色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察。表達(dá)AR蛋白的陽性細(xì)胞呈深藍(lán)色或藍(lán)色，陰性對照組細(xì)胞不表達(dá)AR蛋白,呈與背景色相似的淡藍(lán)色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

表1 AR陽性細(xì)胞平均灰度值Table 1 Average gray scale of AR+ cell (±SD)

由圖1和表1可知，GM+T組AR蛋白在弓狀核中有表達(dá)。陽性產(chǎn)物灰度值均較GM組低(灰度值越低，著色越強(qiáng))，AR陽性細(xì)胞數(shù)目比GM組顯著增多，差異顯著(Plt;0.05)，染色加深，接近正常水平；IMC組中AR蛋白主要分布于靶細(xì)胞胞質(zhì)中，陽性細(xì)胞數(shù)目極顯著增多，差異極顯著(Plt;0.01)；GM組中AR蛋白的表達(dá)率則相對較低。

圖1 弓狀核中AR免疫陽性產(chǎn)物 (400×)Figure 1 The expression of AR in arcuate nucleus (400×)

3 討論

下丘腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的最重要部位。劉曉柳等[1]首次分別從基因水平和細(xì)胞水平證實(shí)了AR在下丘腦的存在。而弓狀核是下丘腦與垂體聯(lián)系的核心部位，能夠合成及分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)及肽類物質(zhì)。損毀弓狀核可導(dǎo)致睪酮分泌降低和睪丸萎縮[5]。Mong等[6]用丙酸睪酮處理閹割雄性大鼠后,弓狀核的突起長度和分化頻率以及神經(jīng)元的分化均顯著增加。Zwain等[7]證實(shí)雄激素和下丘腦神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)相關(guān)。已有大量文獻(xiàn)證明雄激素對機(jī)體生殖有調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體表達(dá)于弓狀核中，證實(shí)生殖系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的密切聯(lián)系。提示弓狀核可能對生殖活動具有調(diào)節(jié)。

雄激素和下丘腦弓狀核的相關(guān)文獻(xiàn)已有較多報道[5,6]。但雄激素對弓狀核中雄激素受體表達(dá)的調(diào)節(jié)研究尚處于起步階段[1]，本研究證實(shí)了AR蛋白在弓狀核的存在，且阻斷內(nèi)源性雄激素對弓狀核中AR表達(dá)有明顯影響，為研究雄激素對弓狀核的調(diào)節(jié)作用提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。同時本實(shí)驗(yàn)采用30 μm冰凍切片，提高了免疫陽性產(chǎn)物的對比度。雄激素進(jìn)行調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能時，都依賴自身受體完成[2]。研究表明,雄激素可以通過雄激素受體介導(dǎo)的雄激素信號途徑激活或抑制與細(xì)胞生存相關(guān)的基因,比如熱休克蛋白家族[8]，使抗氧化蛋白表達(dá)增加[9]；通過AR依賴性的、快速的促分裂原活化蛋白激酶，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制[10]。本研究中GM組雄激素受體表達(dá)明顯低于IMC組和GM+T組，說明雄激素可能與弓狀核行使的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能相關(guān)。

[1]劉曉柳，李光千，趙小明.雄性大鼠下丘腦雄激素受體蛋白及其mRNA表達(dá)的探討[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2003,19(4):423～426.

[2]黃寶鋒，劉智皓，吳風(fēng)瑞，等.雄激素受體的結(jié)構(gòu)和功能[J].四川動物,2008,27(2):307～310.

[3]張殿明，徐隆紹.神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,1991.37～38.

[4]蔣文華.神經(jīng)解剖學(xué)[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社,2002.297～308.

[5]許 潔，秦 偉.壬基酚對雄性大鼠弓狀核神經(jīng)元單位放電的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2007,23(1):5～6.

[6]Mong J A, Glaser E, McCarthy M M,etal. Gonadal steroids promote glial differentiation and alter neuronal morphology in the developing hypothalamus in a regionally specific manner[J].Neuroscience,1999,19:1464～1472.

[7]Zwain I H, Yen S S. Dehydroepiandrosterone: biosynthesis and metabolism in the brain[J]. Endocrinology, 1999,140:880～887.

[8]Zhang Y, Champagne N, Beitel L K,etal. Estrogen and androgen protection of human neurons against intracellular amyloid beta1-42 toxicity through heat shock protein 70 [J]. J Neurosci,2004,24:5315～5321.

[9]Chisu V, Manca P, Zedda M,etal. Effects of testosterone on differentiation and oxidative stress resistance in C1300 neuroblas toma cells [J]. Neuro Endocrinol Lett, 2006,27:807～812.

[10]Nguyen T V, Yao M, Pike C J. Androgens activate mitogen-activated protein kinase signaling: Role in neuroprotection [J]. J Neurochem, 2005,94:1639～1651.

2009-07-08

田光明(1979-)，男，江蘇鹽城人，理學(xué)碩士，助教，研究方向?yàn)樯窠?jīng)生物學(xué).

范光麗，E-mail:guanglifan@yahoo.com.cn.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.013

Q955

A

1673-1409(2009)04-S044-02