草坪草褐斑病菌次生代謝物的生物活性測定

孫淑琴　劉水芳　楊秀榮

摘要:以病原菌的致病因子為出發(fā)點(diǎn),對病原菌次生代謝物的生物活性進(jìn)行了測定。研究結(jié)果表明,立枯絲核菌的代謝產(chǎn)物能引起與病原相似的病斑,并且毒害作用大小與其致病力存在一定相關(guān)性。代謝產(chǎn)物對胚根伸長、胚芽生長均造成一定影響,抑制作用可分別達(dá)到42.06%~91.20%、2.31%~18.79%,但對種子發(fā)芽率無太大影響。

關(guān)鍵詞:草坪褐斑病;次生代謝物;生物活性

中圖分類號:S432.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1006-6500(2009)02-0075-03

Bioactivity Assay of Secondary Metabolites of Rhizoctonia solani

SUN Shu-qin,LIU Shui-fang,YANG Xiu-rong

(Tianjin Institute of Plant Protection,Tianjin300112,China)

Abstract:In this paper, the bioactivity of secondary metabolites that was the pathogenic factor of brown patch disease probably was assayed. The results showed that disease spots that caused by metabolites was similar to that of pathogen and the pathogenicity and the toxicity effect had some correlations. Secondary metabolites had not great influence on the germination rate but had some influence on the growth of radicle and embryo, the inhibition effect was 42.06%~91.20% and 2.31%~18.79%, respectively.

Key words: brown patch disease;secondary metabolites;bioactivity

草坪褐斑病(Brown Patch Disease)又稱夏枯病或立枯絲核疫病,是報(bào)道最早、分布最廣的草坪草病害之一。受害草坪在發(fā)病條件適合時(shí),短時(shí)間內(nèi)可發(fā)展成2 m左右的枯草斑,極大地影響草坪的觀賞價(jià)值和使用價(jià)值,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

草坪褐斑病病原主要是絲核菌屬的立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)。研究表明,立枯絲核菌菌株的代謝產(chǎn)物與其對寄主的致病能力存在顯著正相關(guān),說明代謝產(chǎn)物在病原菌的致病過程中起重要作用。本研究對草坪草褐斑病病原菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了生物活性測定,以明確代謝物在致病過程中的作用,并為病害的防治提供可靠的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1立枯絲核菌致病性測定

采用噴霧接種法,把采自天津市的20份褐斑病病原立枯絲核菌接種到修剪后的盆栽高羊茅葉片上。接種后覆膜保濕24 h,一周后調(diào)查病害發(fā)生情況,篩選強(qiáng)、弱致病力菌株。

1.2立枯絲核菌代謝產(chǎn)物的生物活性測定

1.2.1代謝產(chǎn)物的制備將菌株R.H2、R.S1在PDA上擴(kuò)大培養(yǎng)后,用直徑0.5 cm打孔器在菌落邊緣打孔,挑5塊菌絲塊接種于150 mL PS培養(yǎng)液中,25 ℃靜置培養(yǎng)15 d。培養(yǎng)液2層濾紙過濾后備用。

1.2.2代謝產(chǎn)物對離體葉片的致病性在培養(yǎng)皿中先鋪2層濾紙,加入10 mL無菌水,再在濾紙上置2個(gè)載玻片,將高羊茅葉片置載玻片上。用微量注射器針刺高羊茅葉片造成傷口,在傷口處分別放直徑0.5 cm的菌盤和20 μL代謝液,以蒸餾水為對照,置室溫培養(yǎng)。3 d后觀察傷口處癥狀。

1.2.3代謝產(chǎn)物對高羊茅胚根、胚芽生長的抑制作用用55～60 ℃溫水浸泡高羊茅種子,表面消毒2 h,再用絲核菌代謝產(chǎn)物浸泡6 h,紗布包好后置培養(yǎng)箱中催芽3 d。挑取一致的種芽測量胚根、胚芽長度后,放入鋪有2層濾紙含10 mL代謝液的培養(yǎng)皿中,每皿20粒,以含10 mL水的培養(yǎng)皿為對照,每處理3次重復(fù)。25 ℃培養(yǎng)3 d后測量胚根、胚芽長度,計(jì)算凈增量和抑制率。

1.2.4代謝產(chǎn)物對高羊茅種子發(fā)芽率的影響將病原菌代謝液10 mL注入鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中,每皿放入100粒高羊茅種子,設(shè)含10 mL水的培養(yǎng)皿為對照,每處理3次重復(fù)。3 d后檢測種子的發(fā)芽率。

2結(jié)果與分析

2.1立枯絲核菌致病性測定

葉片發(fā)病后按以下標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查葉片病情指數(shù)。0級:無病斑;1級:病斑面積占葉面積的10%以下;2級:病斑面積占葉面積的10%～25%;3級:病斑面積占葉面積的26%～50%;4級:病斑面積占葉面積的51%～70%;5級:病斑面積占葉面積的71%以上。

調(diào)查結(jié)果表明,接種的20份褐斑病病原均可引起高羊茅發(fā)病,但發(fā)病程度不同,病情指數(shù)在18%～76%。選取高病情指數(shù)即強(qiáng)致病力菌株R.H2和低病情指數(shù)即弱致病力菌株R.S1作為目標(biāo)菌。

2.2立枯絲核菌代謝產(chǎn)物的生物活性測定

2.2.1代謝產(chǎn)物對離體葉片的致病性針刺葉片分別接種絲核菌R.H2和R.S1的菌盤、代謝液,結(jié)果表明,立枯絲核菌代謝產(chǎn)物可在一定程度上引起高羊茅葉片產(chǎn)生褐斑病病斑,但發(fā)病程度不同:R.H2菌盤>R.H2代謝液>R.S1菌盤>R.S1代謝液。病斑褪綠,呈圓形、橢圓形至不規(guī)則形,顏色為褐色。對照處理在針刺點(diǎn)處只有極小的枯死圈,而無病斑和褪綠斑。據(jù)此可以推測絲核菌代謝產(chǎn)物中含有對葉片有一定的毒害作用的物質(zhì),病原菌浸染草坪草后,病斑的形成可能與其有關(guān)。并且代謝物的毒害作用大小與病原菌的致病力強(qiáng)弱有一定的相關(guān)性。

2.2.2代謝產(chǎn)物對高羊茅胚根、胚芽生長的抑制作用研究結(jié)果表明(表1、表2),強(qiáng)致病力菌株R.H2處理的胚根根尖生長點(diǎn)變褐,伸長受到很大的抑制,3 d內(nèi)由處理前的23 mm增長為處理后的23.9 mm,生長抑制率達(dá)91.20%,而胚芽伸長受到的影響較小,抑制率為18.79%。弱致病力菌株R.S1處理后,根尖顏色無變化,生長受到較小抑制,由處理前的17.4 mm增長為處理后的23.3 mm,生長抑制率為42.06%,胚芽生長抑制率僅為2.31%。經(jīng)SSR方差分析結(jié)果顯示,菌株R.H2與R.S1代謝產(chǎn)物對胚根、胚芽的毒害作用大小均存在顯著差異。

2.2.3代謝產(chǎn)物對高羊茅種子發(fā)芽率的影響不同處理的種子發(fā)芽率測試表明,各處理對種子發(fā)芽率無太大影響且各處理間差距不大,說明絲核菌代謝產(chǎn)物對種子發(fā)芽率無明顯影響。

3討 論

本試驗(yàn)初步研究了草坪草褐斑病病原立枯絲核菌的次生代謝物的生物活性,結(jié)果表明,代謝物能引起與病原相似的病斑,并對高羊茅種子胚根、胚芽的伸長造成影響,而對種子的發(fā)芽率無影響,并且強(qiáng)致病力菌株R.H2與弱致病力菌株R.S1的代謝產(chǎn)物對離體葉片的致病作用、對胚根和胚芽的毒害作用均有明顯的差異,表明草坪草褐斑病的代謝產(chǎn)物的毒害作用大小可能與其致病性存在相關(guān)性。這些結(jié)果均與有關(guān)報(bào)道一致。

近幾十年的研究成果表明,植物病原物產(chǎn)生的對寄主植物有害的代謝產(chǎn)物主要有酶、毒素和激素等。很多研究認(rèn)為,病菌代謝產(chǎn)物的多少及其活力大小影響其致病力強(qiáng)弱。國內(nèi)外對草坪草褐斑病已做了大量研究,但有關(guān)病原菌代謝產(chǎn)物的報(bào)道很少,多見于同屬的病原菌。Sriram等提出水稻紋枯病病原立枯絲核菌的致病性與產(chǎn)生的毒素有關(guān)。徐艷等研究表明水稻紋枯病病原立枯絲核菌能產(chǎn)生毒素,并且毒素在病菌致病過程中起重要作用。張華東等研究表明水稻紋枯病病原立枯絲核菌菌株的產(chǎn)毒能力與其對水稻植株的致病能力存在顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.825 5。徐敬友等在研究水稻紋枯病菌時(shí)認(rèn)為,病原菌的致病因子有毒素和細(xì)胞壁降解酶2種因子,其中哪個(gè)因子更重要一些,有待進(jìn)一步研究。Bateman等則認(rèn)為果膠酶是立枯絲核菌的致病因子。

本研究的結(jié)果表明,草坪草褐斑病病原立枯絲核菌的代謝產(chǎn)物在在致病過程中發(fā)揮重要作用,至于代謝產(chǎn)物中發(fā)揮作用的物質(zhì)是毒素還是細(xì)胞壁降解酶或果膠酶或是兩者共同作用,正在進(jìn)一步研究中。

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