一株降解甲氰菊酯的光合細(xì)菌的分離鑒定及其降解酶初步分析

羅源華　張戰(zhàn)泓　劉　勇　張松柏　張德詠　羅香文　成飛雪

摘要:從某農(nóng)藥廠污泥中篩選分離出一株高效降解甲氰菊酯(Fenpropathrin)的光合細(xì)菌,研究了其降解特性及生物學(xué)特性。根據(jù)分離菌株的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、活細(xì)胞光吸收特征、生理生化特征及其16S rDNA序列同源性鑒定降解菌;氣相色譜法測定該菌降解甲氰菊酯的能力;采用超聲波破碎法提取該菌降解粗酶,利用(NH4)2SO4分段鹽析并測定酶活性。結(jié)果表明:PSB07-14屬紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas sp.);該菌以共代謝方式降解甲氰菊酯,對甲氰菊酯的最高耐受濃度為800 mg/L,降解最佳條件為:30～35 ℃、pH6～7,光照培養(yǎng)15 d對600 mg/L甲氰菊酯降解率達(dá)48.41%。降解酶測定結(jié)果表明:30%～60%(NH4)2SO4沉淀的蛋白降解活性最高。

關(guān)鍵詞:甲氰菊酯;紅假單胞菌;生物降解;降解酶

中圖分類號(hào):X172文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1006-6500(2009)02-0001-05

Isolation, Identification of Fenpropathrin-degrading Strain PSB07-14 and Preliminary Analysis of Its Degradation Crude Enzyme

LUO Yuan-hua1,ZHANG Zhan-hong3,LIU Yong1,2,ZHANG Song-bai1,2,ZHANG De-yong1,2,LUO Xiang-wen1, CHENG Fei-xue1

(1.Hunan Plant Protection Institute,Changsha,Hunan 410125,China;2. Branch of Longping,Graduate College,Central South University,Changsha,Hunan 410125,China;3. Hunan Vegetable Institute,Changsha,Hunan 410125,China)

Abstract:A photosynthetic bacterial strain PSB07-14, with degradability of fenpropathrin, was isolated and identified as Rhodopseudomonas sp. based on its morphology, physiology and homology of 16S rDNA sequence. The degrading characteristics showed the optimum conditions of degrading fenpropathrin were 30～35 ℃, pH 6～7, respectively. This strain could grow in the media supplied with fenpropathrin up to 800 mg/Land degrade fenpropathrin by co-metabolic way. The degradation rate of fenpropathrin was up to 48.41% in a concentration of 600 mg/L within 15 d. The degradation crude enzyme was extracted and subsided by (NH4)2SO4, the results of subsiding enzyme activity showed the highest enzyme activity appeared in the subsiding of 30%～60%(NH4)2SO4.

Key words: fenpropathrin;Rhodopseudomonas sp. PSB07-14;biodegradation;degradation enzyme

甲氰菊酯,化學(xué)名稱2-氰基-3-苯氧基芐基-2,2,3,3-四甲基環(huán)丙烷酸酯,商品名滅掃利,對鱗翅目、同翅目、半翅目、雙翅目、鞘翅目等多種害蟲有效,同時(shí)對多種害螨的成螨、若螨和螨卵有一定的防治效果[1],適用于棉花、蔬菜、果樹、玉米、大豆、煙草、茶葉等作物以及林木、家畜、衛(wèi)生和倉儲(chǔ)等害蟲防治,對一些農(nóng)作物還有促進(jìn)生長、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)的作用。

雖然甲氰菊酯對高等動(dòng)物毒性中等,在試驗(yàn)劑量內(nèi)對試驗(yàn)動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)致畸、致突變和致癌作用。但是,對魚類等水生生物、蜜蜂、家蠶等高毒,對光、熱、潮濕穩(wěn)定,在環(huán)境中的半衰期較長,長期使用,環(huán)境中大量殘留,會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。這迫使我們尋找一種切實(shí)有效的方法來解決這一難題 [2,3]。以生物修復(fù)(Bioremediation)為理論基礎(chǔ)的農(nóng)藥殘留降解菌技術(shù)為降低農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中的農(nóng)藥殘留物提供了希望,該技術(shù)具有高效、無毒、無二次污染的特點(diǎn),而且經(jīng)濟(jì)實(shí)用,操作簡便,目前已成為去除農(nóng)藥殘留污染的一種重要方法。國內(nèi)外有很多關(guān)于農(nóng)藥殘留降解菌研究的報(bào)道,由于菊酯類農(nóng)藥在20世紀(jì)80年代才在我國廣泛使用,對該類農(nóng)藥的研究起步較晚,對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解菌報(bào)道相對較少[3,4]。因此,篩選更多類型的甲氰菊酯高效降解菌,對甲氰菊酯殘留的生物修復(fù)研究和應(yīng)用具有十分重要的意義。

筆者從某農(nóng)藥廠污泥中分離到一株能降解甲氰菊酯的光合細(xì)菌PSB07-14,對其降解甲氰菊酯的特性進(jìn)行了研究。該研究為利用光合細(xì)菌降解甲氰菊酯殘留及其降解機(jī)理、克隆降解酶基因打下了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1培養(yǎng)基、試劑和主要儀器

光合細(xì)菌(PSB)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基添加0.15%酵母膏,參照文獻(xiàn)[5];選擇培養(yǎng)基:在PSB培養(yǎng)基中加入一定濃度的甲氰菊酯;固體培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。

主要試劑:40 %甲氰菊酯乳油,海南正業(yè)化工有限公司惠贈(zèng);98 %甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品購自天津東方綠色技術(shù)發(fā)展有限公司;其它農(nóng)藥殘留檢測試劑均為色譜純。

主要儀器:農(nóng)藥殘留檢測在湖南省植物保護(hù)研究所農(nóng)藥殘留檢測室進(jìn)行。6890N氣相色譜儀 (Agilent, USA)、掃描電子顯微鏡(JEXL-230,日本電子公司)、分光光度計(jì)(Tu-1901,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、光照培養(yǎng)箱(GZP-350,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2培養(yǎng)條件

光合細(xì)菌培養(yǎng)采用130 mL的血清瓶。培養(yǎng)條件(除特別說明外):厭氧光照培養(yǎng),(30±2)℃,2 000 lx光照培養(yǎng)6～7 d;黑暗好氧培養(yǎng),黑暗條件下,(30±2)℃,培養(yǎng)6～7 d。每天搖瓶混勻1次。

1.3降解菌的分離、篩選

將采自某農(nóng)藥廠的污泥2.0 g加入120 mL PSB培養(yǎng)基中,光照培養(yǎng)7 d后,取1%菌液接種到含甲氰菊酯100 mg/L的選擇性液體培養(yǎng)基中,光照培養(yǎng)7 d,取300 μL菌液稀釋涂布到選擇性固體培養(yǎng)基中,挑取菌落形態(tài)不同的菌,分別接種到含甲氰菊酯100 mg/L選擇性液體培養(yǎng)基中,光照培養(yǎng)7 d,取1%分別接種到含甲氰菊酯200,400,600,800,1 000 mg/L選擇培養(yǎng)基中,15 d后檢測培養(yǎng)基農(nóng)藥濃度,以含相同濃度的甲氰菊酯,相同培養(yǎng)條件不接種細(xì)菌的培養(yǎng)基為對照。選擇降解率最大的細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)研究,命名為PSB07-14,后續(xù)試驗(yàn)中1 mL菌液中約含活細(xì)胞109個(gè)。

1.4菌種的鑒定

1.4.1電鏡樣品制備及觀察將活的細(xì)菌滴到具膜載網(wǎng)上,然后進(jìn)行磷鎢酸染色,TEM(transmission- scanning electron microscope)觀察拍照。

1.4.2吸收光譜的測定取1.5 mL培養(yǎng)5 d的光合細(xì)菌培養(yǎng)液,8 000 r/min離心洗滌3次,用0.9 %生理鹽水重懸浮,在分光光度計(jì)上于200～900 nm掃描。

1.4.3菌株的生理生化特征的測定見參考文獻(xiàn)[6]。

1.4.4菌體16S rDNA序列的測定及同源性分析細(xì)菌基因組提取采用UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。以所提的細(xì)菌總DNA為模板,采用細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增[5],PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×PCR Buffer 2.5 μL;MgCl2(25 mmol/L) 2 μL;dNTP(10 mmol/L) 2 μL;引物Bpf/Bpr(25 μmol/L) 各0.5 μL;Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL;雙蒸水 43 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循環(huán)30次;72 ℃ 10 min。反應(yīng)完成后,經(jīng)1%瓊脂糖電泳,檢測擴(kuò)增片斷的大小和特異性。PCR產(chǎn)物純化后,委托上海生工生物工程公司測序。將PSB07-14測得的16S rDNA序列在Genbank中利用blast進(jìn)行比對,比較不同細(xì)菌間的相似性。

1.5甲氰菊酯含量的測定

整瓶培養(yǎng)液,用正己烷萃取3次,每次用量分別為40,40,30 mL。氮吹儀上吹干,然后用正己烷溶解并定容至10 mL,接著加入無水硫酸鈉脫水。氣相色譜測定其含量[4]。以98 %甲氰菊酯標(biāo)樣定性定量,所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值。

測試條件:氣相色譜儀型號(hào)Agilent 6890N,色譜柱型號(hào)為HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm),采用程序升溫法:毛細(xì)管柱起始溫度160 ℃,保持5 min,10 ℃/min升至200 ℃,保持1 min,10 ℃/min升至280 ℃,保持8 min,檢測器(μECD)溫度320 ℃,進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣為N2(純度99.999 9 %),流量1 mL/min。進(jìn)樣量均為1 μL。

降解率的計(jì)算方法:降解率=(1-C1/C0)×100%

其中,C1為降解菌處理甲氰菊酯殘留濃度(mg/L),C0為對照處理甲氰菊酯殘留濃度(mg/L)。

1.6 降解酶的提取與鹽析

15 mL離心管加入10 mL培養(yǎng)7 d的PSB07-14菌液,8 000 r/min離心2 min,倒去上清液,重復(fù)1次,收集菌細(xì)胞,倒去上清液,加入等體積的PBS(pH7.2)緩沖液,降解粗酶的提取采用超聲波破碎儀破碎菌體細(xì)胞[7],12 000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液,考馬氏亮藍(lán)法測定蛋白的濃度[8],用PBS緩沖液調(diào)整蛋白濃度為10 mg/L做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取50 mL粗酶液,加入(NH4)2SO4鹽析,靜置10 min,離心收集沉淀,PSB(pH7.2)緩沖液溶解,并調(diào)整蛋白濃度為1 mg/mL[8]。酶活力測定參照文獻(xiàn)[7],本試驗(yàn)的1個(gè)酶活力單位(U)定義為在本試驗(yàn)條件下1 min內(nèi)甲氰菊酯減少的微摩爾數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1菌株鑒定

2.1.1培養(yǎng)特征和活細(xì)胞光吸收特征培養(yǎng)結(jié)果表明,PSB07-14最佳生長溫度為30～35 ℃、pH6.5～7.5,具有紅色培養(yǎng)物、黑暗好氧生長慢以及耐鹽低于3%的Rhodopseudomonas的特征[6]?；罴?xì)胞光吸收結(jié)果表明(圖1),該菌含有細(xì)菌葉綠素a及類胡蘿卜素[5],表明該菌屬于紫色非硫細(xì)菌。

2.1.2形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特征圖2的電鏡結(jié)果表明,PSB07-14為桿狀,大小為0.6～1.0 μm×2.4～3.1 μm,端生鞭毛,以二分裂方式繁殖。生理生化分析結(jié)果表明(表1):G-,V-P反應(yīng)陰性,甲基紅反應(yīng)陰性,不能利用淀粉,H2S反應(yīng)陰性;可以利用多種小分子的有機(jī)酸生長,也能利用部分氨基酸和醇類化合物進(jìn)行生長。PSB07-14的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特征與Rhodopseudomonas基本一致[6]。

2.1.316S rDNA序列分析PSB07-14測定的16S rDNA序列長度為1 429 bp (Genbank accession No.FJ798824),Blast結(jié)果表明,在Genebank中,與Rhodopseudomonas palustris strain HZ-1 (EU703955)和Rhodopseudomonas sp. TUT3625 (AB250616) 的同源性分別為98%和97%。

2.1.4鑒定結(jié)果根據(jù)Bergeys Manual of Determinative Bacteriology[6],將PSB07-14鑒定為Rhodopseudomonas sp.。

2.2菌株對甲氰菊酯的降解

2.2.1對甲氰菊酯的耐受濃度在120 mL PSB液體培養(yǎng)基中,加入5 mL菌液和適量甲氰菊酯,使培養(yǎng)基中甲氰菊酯終濃度為200,400,600,800,1 000 mg/L,光照培養(yǎng),第15 天觀察PSB07-14的生長情況。結(jié)果如表2示,PSB07-14耐受甲氰菊酯的最大濃度為800 mg/L。

2.2.2對甲氰菊酯的降解120 mL的PSB液體培養(yǎng)基中加入5 mL PSB07-14和適量甲氰菊酯,使其最終濃度為600 mg/L,光照培養(yǎng)15 d取樣測定甲氰菊酯的殘留量,以含600 mg/L甲氰菊酯培養(yǎng)液為對照。甲氰菊酯在光照下,經(jīng)過15 d有一定量的降解,可見光照對甲氰菊酯有一定的降解效果,但作用并不是很大(4.13%)。PSB07-14在600 mg/L甲氰菊酯培養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d,對甲氰菊酯的降解率為48.41%(表3)。

2.2.3最佳降解條件在pH為5,6,7,8,9,10的120 mL的PSB培養(yǎng)基中,加入5 mL的PSB07-14菌液和適量甲氰菊酯,其最終濃度600 mg/L,光照培養(yǎng)15 d后取樣,樣品經(jīng)萃取后檢測甲氰菊酯殘留量。結(jié)果表明(圖3),pH在6～8之間,PSB07-14的降解效能都比較好,最適pH為7。

在120 mL含甲氰菊酯600 mg/L的PSB培養(yǎng)基中,加入5 mL的PSB07-14菌液,不同溫度下,光照培養(yǎng)15 d后測定甲氰菊酯殘留量。圖4表明,PSB07-14在25～35 ℃之間,具有良好的甲氰菊酯降解能力,在35 ℃降解能力最好。溫度過高或過低都顯著影響菌株的降解能力,當(dāng)溫度低于25 ℃或高于45 ℃,菌株幾乎喪失降解能力。

2.2.4菌株對甲氰菊酯的共代謝特點(diǎn)PSB07-14在以甲氰菊酯為唯一碳源的PSB培養(yǎng)基中不生長(表4),但在有其他碳源(酵母膏)存在時(shí)可以降解甲氰菊酯,表明PSB07-14是以共代謝的方式降解甲氰菊酯[9]。

2.3分段鹽析粗蛋白降解活性

分段鹽析粗蛋白降解活性表明,30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性為38.27 U/L,大大高出0～30%、60%～80%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白的活性(表5)。

3討 論

通過富集培養(yǎng)法分離出甲氰菊酯降解菌PSB07-14,生理生化方法和16S rDNA序列同源性將其鑒定為Rhodopseudomonas sp.。在農(nóng)藥殘留的降解菌研究中,光合細(xì)菌的研究報(bào)道相對較少;光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria, PSB)是地球上最早出現(xiàn)的具有原始光能合成體系的原核生物。近年來,對光合細(xì)菌的應(yīng)用研究獲得了很大的進(jìn)展。研究表明,光合細(xì)菌在種植、養(yǎng)殖、新能源開發(fā)利用以及醫(yī)藥方面具有十分廣闊的前景[10-13]。在環(huán)境治理方面,光合細(xì)菌可以有效地處理有機(jī)廢水[14],凈化水質(zhì)[15],降解芳香族化合物[13]。在農(nóng)藥降解方面,光合細(xì)菌可以有效地降解有機(jī)磷農(nóng)藥[5]、 硫代磷酸酯類農(nóng)藥[16]。而且光合細(xì)菌具有很好的促進(jìn)作物生長和提高作物抗逆性的作用[17],因此,篩選光合細(xì)菌降解菌具有良好的應(yīng)用前景。

PSB07-14對高濃度的甲氰菊酯具有良好的降解效果,在600 mg/L甲氰菊酯培養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d,對甲氰菊酯的降解率為48.41%。高于丁海濤等[18]分離的降解菌降解速率以及筆者先前分離的光合細(xì)菌株P(guān)SB07-19[19],與洪源范等[9]分離的降解菌降解速率相當(dāng)。PSB07-14降解甲氰菊酯的最佳條件與該菌生長的最佳條件基本一致,表明該菌具有潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

PSB07-14不能以甲氰菊酯作為唯一碳源,只能以共代謝的方式降解甲氰菊酯。表明PSB07-14對甲氰菊酯的降解作用是一種酶促反應(yīng),該結(jié)果與洪源范等[9]的研究結(jié)果一致。

PSB07-14降解酶分段鹽析結(jié)果表明,在30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性為38.27 U/L,該研究為降解酶的分離純化提供了參考。其降解酶的研究以及降解酶基因的克隆是下一步的工作方向。

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