陳醋體外抗栓及溶栓活性的研究

暢曉潔　王慧敏　范俊峰

摘要 分別采用試管凝塊法和纖維蛋白平板法首次研究了陳醋的體外抗栓及溶栓的功能活性,研究發(fā)現(xiàn),陳醋能明顯地延緩凝塊形成時(shí)間,并且能起到良好的溶栓作用,初步證明,其中具有抗栓、溶栓活性的物質(zhì)主要是有機(jī)酸,尤其是醋酸,但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其中還有其他成分具有相同作用。

關(guān)鍵詞 陳醋;抗栓;溶栓;醋酸活性

中圖分類號(hào) Q946.81.+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739(2009)13-0344-03

醋在我國(guó)飲食文化中占有重要地位,它既是傳統(tǒng)食品調(diào)味品,同時(shí)又藥食同用。在古代就有很多關(guān)于醋的生理功能記載,《本草綱目》中記載:醋能“消腫痛,散水氣,殺邪毒,理諸藥”;清代王士雄《隨息居飲食譜》較深刻地歸納食醋的保健功效是“開胃、養(yǎng)肝、強(qiáng)筋、暖骨、醒酒、消食、下氣、辟邪、解魚蟹鱗介諸毒”?，F(xiàn)代研究認(rèn)為,醋可清除自由基、降血壓、防癌、預(yù)防骨質(zhì)疏松,抑菌、殺菌,并對(duì)心肌梗塞、動(dòng)脈硬化、高血壓等疾病有良好的療效。

血栓及相關(guān)疾病如腦缺血、高血壓、冠心病及動(dòng)脈粥樣硬化等已成為危害人類健康的第一殺手。現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為,膳食中的功能性成分對(duì)于人體健康有重要作用。最新研究表明,醋能改善血液的流變性,具有很好的生物調(diào)節(jié)功能。但是關(guān)于醋對(duì)于血栓形成的防治作用還沒有被人們認(rèn)識(shí)到。

陳醋是我國(guó)四大名醋之一,在我國(guó)北方非常流行。小雜糧是傳統(tǒng)的保健食品,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)小雜糧具有豐富的功能性成分,陳醋主要是以高粱為主的小雜糧為原料經(jīng)特殊工藝釀造而成的。筆者評(píng)價(jià)了陳醋的體外抗栓及溶栓活性,并對(duì)其中的生理活性物質(zhì)進(jìn)行了初步探索。

1 材料與試劑

1.1 試驗(yàn)材料

陳醋(黑苦蕎醋、黑燕麥醋、黑高粱醋、黑小麥醋、黑小米醋,山西汾陽(yáng)紫苑微生物開發(fā)利用研究所生產(chǎn))、牛纖維蛋白原(中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn),98mg可凝蛋白/支)、凝血酶原(中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn),每支210Bp)、瓊脂糖(電泳用,10g,浙江溫州洞頭縣藍(lán)鳥海藻生物制品廠生產(chǎn))、圓片超濾平膜(截留分子量為5 000和30 000,上海摩速科學(xué)器材有限公司生產(chǎn))。

1.2 試驗(yàn)儀器

pH計(jì)(ZD-2型自動(dòng)電位滴定儀,上海精密科學(xué)儀器有限公司出品)、紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司出品)、FD-1真空冷凍干燥機(jī)(北京德天佑科技發(fā)展有限公司出品)、TDL-5型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠出品)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 醋樣酸度的測(cè)定

參照GB/T 5009.41-1996滴定法:食醋中酸的主要成分是乙酸,含有少量其他有機(jī)酸,用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液[C(NaOH)=0.05moL/L]滴定,以酸度計(jì)測(cè)定,pH值為8.2時(shí)為滴定終點(diǎn),結(jié)果以乙酸含量表示。

2.2 醋樣的超濾

將原醋樣置于3 000rpm的離心機(jī)中,離心25min,取上清液,使其依次通過(guò)截留分子量為5 000和30 000孔徑的超濾膜,將醋樣分為分子量小于5 000、5 000～30 000、大于30 000三部分。分離后的這些樣品真空冷凍干燥48h,即得干燥醋樣。

2.3 抗栓活性的測(cè)定

(1)原醋抗栓活性測(cè)定。取醋樣5mL(空白對(duì)照中不加)于小型試管中,依次加入10U/mL的凝血酶原20mL、Tris-HCl緩沖液0.66mL(空白對(duì)照中加0.67mL)、0.2%的牛纖維蛋白原溶液0.3mL,迅速搖勻,靜置,開始計(jì)時(shí)。每隔2～3s緩慢傾斜試管1次,記錄試管中混合液完全凝固,即液面不動(dòng)所需的時(shí)間。每個(gè)醋樣做10個(gè)重復(fù)。用相應(yīng)酸度的醋酸和經(jīng)NaOH中和后的醋樣重復(fù)上述操作。結(jié)果用混合液完全凝固所需的時(shí)間表示。

(2)超濾醋樣不同片段抗栓活性的測(cè)定。將不同分子量段(小于5 000、5 000～30 000、大于30 000)的3種干燥醋樣(黑燕麥醋、黑苦蕎醋、黑高粱醋)加蒸餾水配制成濃度為0.15g/mL的溶液。以20mL配好的醋樣代替5mL原醋樣重復(fù)上述操作。

2.4 纖溶活性的測(cè)定

制作纖溶平板:稱取適量瓊脂糖,加蒸餾水配成0.8%的溶液。將配好的溶液置于80℃水浴鍋中加熱溶解。完全溶解后,將其冷卻至55℃左右,量取16mL倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中,迅速加入81mg/11.6mL牛纖維蛋白原0.8mL,120U/19.2mL凝血酶原0.53mL,搖勻,置于4℃冰箱中放置20min后取出,即制得纖溶平板。

取2個(gè)纖溶平板,每個(gè)平板中間隔90°打孔,分別加具有與黑小麥醋相同酸度的醋酸(后簡(jiǎn)稱醋酸)和另外3種原醋(空白對(duì)照中加經(jīng)NaOH中和后的醋樣)各2mL,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中16h后取出,觀察是否出現(xiàn)溶纖圈。結(jié)果用最大溶纖圈半徑表示。

另取2個(gè)纖溶平板,置于80℃烘箱,30min后取出,使其自然冷卻,重復(fù)上述操作,觀察能否出現(xiàn)溶纖圈。

3 結(jié)果與分析

3.1 醋的酸度

醋樣酸度的測(cè)定,各醋樣的酸度依次為黑小麥醋>黑苦蕎醋>黑高粱醋>黑燕麥醋>黑小米醋>米醋,其中,酸度最強(qiáng)的是黑小麥醋,其酸度為7.25;米醋作為對(duì)照,酸度最弱,為3.7;黑苦蕎醋、黑高粱醋、黑燕麥醋和黑小米醋的酸度分別為7.01、6.67、5.21和4.22?？梢?陳醋中有機(jī)酸含量明顯高于一般米醋。

3.2 抗栓活性

原醋抗栓活性的測(cè)定:試驗(yàn)中所用的所有醋樣均能明顯地延長(zhǎng)凝塊形成時(shí)間,黑小麥醋作用最強(qiáng),在10.7min時(shí)混合液才完全凝固;米醋作為對(duì)照醋樣,其作用最弱,需4.4min;空白對(duì)照需1.8min;黑苦蕎醋、黑高粱醋、黑燕麥醋和黑小米醋中形成凝塊所需的時(shí)間分別為9.7min、9.2min、8.3min和7.6min。當(dāng)用相應(yīng)酸度的醋酸作對(duì)照時(shí),其凝固所需的時(shí)間與原醋樣大致相同;而當(dāng)用中和后的醋樣作對(duì)照時(shí),其凝固時(shí)間與空白大致相同。

超濾醋樣不同片段的抗栓活性測(cè)定,陳醋中除醋酸外的其他成分亦能明顯地延長(zhǎng)凝塊形成時(shí)間,其中,黑苦蕎醋由大到小的3個(gè)分子量段的醋樣完全凝固所需的時(shí)間依次為50.8min、31.7min、17.9min;黑高粱醋依次為42.4min、26.7min、15.7min;黑燕麥醋依次為34.0 min、21.7min、13.9min;空白完全凝固所需的時(shí)間為1.8min。由此可知,對(duì)于同種醋樣,分子量越大,作用效果越明顯;對(duì)于同分子量段的不同種醋樣,其作用強(qiáng)弱依次為黑苦蕎醋>黑高粱醋>黑燕麥醋。

由原醋抗栓活性的測(cè)定結(jié)果可知,陳醋的抗栓作用明顯優(yōu)于對(duì)照米醋;本研究所用的所有醋樣的抗栓作用與其酸度順序一致,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),二者之間具有顯著相關(guān)性(r=0.915 0,P<0.05),考慮到中和后醋樣的測(cè)定結(jié)果,筆者認(rèn)為,醋酸是陳醋中主要抗栓物質(zhì),醋酸的作用可能在于其對(duì)凝血酶的抑制活性;而通過(guò)干燥醋樣的抗栓試驗(yàn),能很明顯地看到除醋酸外,陳醋中還有其他成分有很強(qiáng)的抗栓作用。

3.3 纖溶活性

原醋纖溶活性的測(cè)定,陳醋有很強(qiáng)的纖溶活性,其中黑小麥醋作用最強(qiáng),其最大溶纖圈的半徑為2.5cm;米醋作為對(duì)照醋樣,最大溶纖圈的半徑為1.5cm;醋酸(即與黑小麥醋相同酸度的醋酸)的最大溶纖圈半徑僅為1.0cm;黑苦蕎醋、黑高粱醋、黑燕麥醋和黑小米醋的最大溶纖圈半徑分別為2.4cm、2.1cm、1.9cm和1.8cm;陳醋所形成的溶纖圈的半徑大小依次為黑小麥醋>黑苦蕎醋>黑高粱醋>黑燕麥醋>黑小米醋>米醋>醋酸,其作用強(qiáng)度分別相當(dāng)于0.243U、0.229U、0.187U、0.167U、0.154U、0.114U、0.053U的標(biāo)準(zhǔn)尿激酶活性;中和后的醋樣周圍均未觀察到溶纖圈,同時(shí)在加熱過(guò)的平板中,每種醋樣周圍亦未出現(xiàn)溶纖圈。

由原醋纖溶活性的測(cè)定結(jié)果可知,陳醋的纖溶活性明顯優(yōu)于對(duì)照米醋;參照原醋樣酸度的測(cè)定結(jié)果可知,陳醋的溶纖活性與其酸度順序一致,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),二者之間亦具有顯著相關(guān)性(r=0.959 2,P<0.01);對(duì)比黑小麥醋和經(jīng)NaOH調(diào)節(jié)的與黑小麥醋有相同酸度的醋酸測(cè)定結(jié)果表明,陳醋中還有其他物質(zhì)有溶纖活性;根據(jù)中和后醋樣的對(duì)照結(jié)果可知,陳醋中起溶纖作用的物質(zhì)主要是醋酸;根據(jù)加熱平板的對(duì)照結(jié)果可進(jìn)一步推測(cè),醋酸能激活纖溶酶原,進(jìn)而使其發(fā)揮纖溶作用。

4 討論

機(jī)體血管內(nèi)血栓形成是引發(fā)高血壓、心肌梗死、腦缺血、動(dòng)脈粥樣硬化等諸多疾病的主要病理因素。無(wú)論是氧自由基等化學(xué)誘因,還是缺氧等物理誘因,內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其凝血與溶栓機(jī)能失調(diào)是血栓形成的主要機(jī)制。血液凝固涉及到一系列復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程,這一過(guò)程有2個(gè)主要環(huán)節(jié):一是血漿中凝血酶原受到血漿和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶;二是血漿中的纖維蛋白原肽A(FA)和B(FB)形成單位(αβγ)2后自發(fā)聚合成不穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體,不穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體在Ca2+等的作用下交聯(lián)成穩(wěn)定纖維蛋白多聚體,這就是血栓的主要基質(zhì)。在人類血液纖溶系統(tǒng)中,起中心作用的是纖溶酶及其酶原分子。

本研究通過(guò)試管凝塊法和纖維蛋白平板法,發(fā)現(xiàn)陳醋有很明顯的抗栓及溶栓活性,且證明其中起作用的物質(zhì)主要是醋酸,由試驗(yàn)現(xiàn)象可進(jìn)一步推測(cè):醋酸能抑制凝血酶活性,明顯延長(zhǎng)凝塊形成時(shí)間,且能激活纖溶酶原,進(jìn)而使其發(fā)揮纖溶作用。有學(xué)者通過(guò)在體外模擬血栓形成的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):血栓形成過(guò)程中,全血中原有的血漿纖維蛋白原降至極低,基本上都成了血栓的成分,而且如果沒有纖維蛋白原成分的參與就形不成血栓。由此可見,陳醋對(duì)纖溶酶原的激活作用有著重要意義。陳醋能從抑制凝血酶活性和激活纖溶酶原2個(gè)主要方面作用于血栓,加之其特殊的加工工藝和獨(dú)特的原材料賦予陳醋的重要生理功能,使其成為藥食同源的治療血栓類疾病的理想對(duì)象。在試驗(yàn)過(guò)程中,亦發(fā)現(xiàn)陳醋中除醋酸等有機(jī)酸外,還有其他成分有很強(qiáng)的抗栓及溶栓活性,對(duì)于這些成分的確定有待進(jìn)一步研究。由于血小板在血栓形成過(guò)程中起著重要作用,血栓形成過(guò)程中全血中原有的血小板83.85%成了血栓成分。因此,本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)一步研究有關(guān)陳醋對(duì)血小板聚集的影響。

5 參考文獻(xiàn)

[1] 蕭鳳岐.釀造醋有益健康[J].中國(guó)釀造,1989(1):7-11.

[2] 徐清萍,敖宗華,陶文沂.食醋功能研究進(jìn)展(上)[J].中國(guó)調(diào)味品,2003(12):11-12.

[3] 徐清萍,敖宗華,陶文沂.食醋功能研究進(jìn)展(下)[J].中國(guó)調(diào)味品,2004(1):19-22.

[4] 蘭文軍.富含黃酮的山楂葉抽提物調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其抗栓功能的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2005.

[5] 唐瑜菁.凝血酶激活的纖溶抑制劑與水蛭素對(duì)纖溶的影響[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2005.

[6] SHOKO NISHIDAI,YOSHIMASA NA KAMURA, KOJI TOR-IKAI,et al. Kurosu,a Traditional Vinegai Produced from Unpolished Rice,Suppresses Lipid Peroxidation in Vitro and in Mouse Skin[J]. Biosci. Biotechnol. Biochem.,2000,64(9):1909-1914.

[7] 康志河,楊國(guó)紅,楊曉平.河南省小雜糧生產(chǎn)利用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].雜糧作物,2005,25(1):55-57.

[8] DENGRU LIU,YANG ZHU. Chinese Vinegar and its Solid-State Fer-mentation Process[J].Food Reviews International,2004,20(4):407-424.

[9] ZBIGNIEW SZEWCZUK,'J BERNARD F. Conformationally Restri-cted Thrombin Inhibitors Resistant to Proteolytic Digestion[J].Biochem-istry,1992(31):9132-9140.

[10] JIANPING WU,XIAOLIN DING. Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin I-converting enzyme inhib-itory peptides[J]. Food Research International,2002(35):367-375.

[11] 王駿.鏈霉菌產(chǎn)生的新型纖溶酶的純化、性質(zhì)和基因克隆的研究以及溶栓機(jī)理的初步探討[D].北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),1997.

[12] CHEN S P,HAN Y L,GUO W. Study on the antithrombotic effect of fibrinolytic proteins from Scolopendra subspinipes mutilans subspinipes mutilans[J].Chinese Pharmacological Bulletin,2007,23(8):1088-1092.

[13] 錢民全.血栓形成的生物力學(xué)研究[J].中國(guó)基礎(chǔ)科學(xué)研究進(jìn)展,2000(8):27-30.