酶聯(lián)免疫法檢測(cè)ＨＢｓＡｇ和熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)ＨＢＶ－ＤＮＡ的對(duì)比研究

嚴(yán)　莉　喬翠玲

[摘要] 目的 對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)HBsAg和熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA結(jié)果行對(duì)比研究，探討其臨床意義。方法 對(duì)45例HBsAg陰性的慢性乙型肝炎HBV感染患者采用ELISA檢測(cè)HBVM（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc），同時(shí)采用PCR對(duì)其血清HBV-DNA進(jìn)行定量分析；對(duì)照組為同期慢性乙型肝炎患者。結(jié)果 45例HBsAg陰性慢性乙型肝炎患者中，HBV-DNA陽性率為24.44％。結(jié)論 ELISA法檢測(cè)HBV是不全面的，但PCR只能檢出復(fù)制狀態(tài)的病毒，難以表達(dá)非復(fù)制狀態(tài)的感染，因而用PCR方法檢測(cè)HBV-DNA也不能完全代替血清標(biāo)志物的檢測(cè)。建議必要時(shí)兩者結(jié)合加強(qiáng)對(duì)患者的檢測(cè)，以避免臨床不必要的漏檢。

[關(guān)鍵詞] 慢性乙型肝炎； HBsAg； HBV-DNA； 對(duì)比

[中圖分類號(hào)] R512.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2009）13-26-02

Comparison Research of ELISA and PCR in Examining HBsAg and HBV-DNA

YAN Li1 QIAO Cuiling2

1.Department of Laboratory，The First People's Hospital in Yibin；2.Health School in Yibin，Sichuan 644000

[Abstract] ObjectiveTo compare the clinical value and reliability of ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） and PCR（polymerase chain reaction）in examining HBsAg（hepatitis B surface antigen） and HBV-DNA（hepatitis B virus- DNA）. MethodsExamining HBVM（HBsAg，Anti-HBs，HBeAg，Anti-HBe，Anti-HBc）by ELISA and HBV-DNA by PCR of 45 HBV patients. ResultsOf all the 45 HBV patients，the positive rate of HBV-DNA was 24.44%. ConclusionELISA and PCR can not correctly examine the results and in clinical we should examine blood by both.

[Key Words]HBV； HBsAg； HBV-DNA； Contrast

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種嚴(yán)重危害人類健康和生命的全球性傳染性疾病，HBV持續(xù)感染與肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我國是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染高發(fā)區(qū)，根據(jù)2006年全國人群乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國人群1～59歲人群中HBsAg攜帶率已從1992年的9.75％降至7.18％，按目前HBsAg攜帶率推算，我國仍然有HBsAg攜帶者約9300萬人。目前醫(yī)院臨床上多以血清免疫學(xué)乙型肝炎病毒標(biāo)志物HBVM（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）作為診斷乙型肝炎的重要依據(jù)之一，隨著PCR對(duì)血清HBV-DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，HBsAg陰性不能排除HBV感染已經(jīng)成為共識(shí)，尤其在HBV感染的高發(fā)地區(qū)。本文旨在通過采用酶聯(lián)免疫法和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)兩種方法同時(shí)測(cè)定，并對(duì)HBsAg、HBV-DNA結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

45例患者HBsAg陰性的慢性乙型肝炎患者均為2006年6月～2007年10月門診及住院患者。其中男23例，女22例；年齡24～67歲，平均47歲；均無乙肝疫苗接種史。HBVM檢測(cè)所有病例HBsAg均呈陰性，同時(shí)采用PCR方法對(duì)血清HBV-DNA進(jìn)行定量分析。對(duì)照組45例為同期慢性乙型肝炎患者，其中男17例，女28例；年齡19～59歲，平均42歲。ELISA法檢測(cè)HBsAg、HBeAg、抗-HBc均呈陽性，同時(shí)采用PCR對(duì)血清HBV-DNA進(jìn)行定量分析。慢性乙型肝炎及其病理診斷依照中華肝病學(xué)會(huì)和中華傳染病學(xué)會(huì)2000年西安會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他肝炎病毒感染和其他原因的肝病損害。

1.2 方法

用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)HBVM（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc），試劑盒由上?？迫A生物技術(shù)有限公司提供，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，并采用衛(wèi)生部臨檢中心0407質(zhì)控血清進(jìn)行質(zhì)量控制。結(jié)果判定：s/co≥1為有反應(yīng)性，0.8≤s/co<1為灰區(qū)可疑，s/co < 0.8為無反應(yīng)性。

PCR檢測(cè)血清HBV-DNA試劑盒為中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，儀器為美國PE-5700型PCR擴(kuò)增儀，反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動(dòng)分析計(jì)算HBV-DNA定量結(jié)果，結(jié)果以拷貝/毫升（cp/mL）表示（采用求算術(shù)平均值的方法計(jì)算HBV-DNA平均拷貝數(shù)，遇有無反應(yīng)性結(jié)果，不參加平均值的統(tǒng)計(jì)）。結(jié)果判定：≥1000cp/mL為有反應(yīng)性，< 1000cp/mL為無反應(yīng)性。

2 結(jié)果

45例HBsAg陰性的慢性乙型肝炎患者中，HBV-DNA陽性率為24.44％，單獨(dú)抗-HBs陽性的慢性肝炎組HBV-DNA陽性率為16.67％，抗-HBe、抗-HBc并存者HBV-DNA陽性率為25％，抗-HBs、抗-HBe及抗-HBc三者陽性的慢性乙型肝炎患者HBV-DNA陽性率為25％，單一的抗-HBc陽性的慢性乙型肝炎組HBV-DNA陽性率為28.57％，HBVM 5項(xiàng)指標(biāo)均為陰性的患者血清HBV-DNA陽性率為25％，具體結(jié)果見表1。

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是將酶的催化反應(yīng)與抗原抗體的免疫學(xué)反應(yīng)結(jié)合起來的一種技術(shù)，由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、易于自動(dòng)化且無放射性污染等諸多優(yōu)點(diǎn)成為應(yīng)用最廣泛、發(fā)展最快的一種免疫測(cè)定技術(shù)，但ELISA法操作環(huán)節(jié)較多，再加上抗原、抗體的變異，較長(zhǎng)的“窗口期”、洗滌時(shí)殘留、孔與孔之間交叉污染、標(biāo)本本身及工作人員操作熟練程度等多種偶然因素的影響，都會(huì)導(dǎo)致一定的假陽性率。標(biāo)本中HBsAg滴度過高也會(huì)因?yàn)槌霈F(xiàn)“后滯現(xiàn)象”而導(dǎo)致弱陽性或假陰性。國外ELISA試劑通常定義一段“灰區(qū)”的檢測(cè)范圍，結(jié)果報(bào)告“可疑”，而國內(nèi)無一廠家對(duì)HBsAg的灰區(qū)進(jìn)行設(shè)定，各醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)灰區(qū)的理解也未達(dá)成共識(shí)，在報(bào)告模式上則只報(bào)告陰性和陽性，因此普遍存在結(jié)果不一致的現(xiàn)象。即ELISA法檢測(cè)HBV是不全面的，醫(yī)院?jiǎn)螒{HBsAg檢測(cè)無反應(yīng)性來判斷血液無傳染性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

PCR作為一種體外基因擴(kuò)增技術(shù)，是利用目的特異性引物在聚合酶的作用下，以四種單核苷酸為底物，在體外短時(shí)間內(nèi)將模板DNA的一個(gè)區(qū)段進(jìn)行幾何級(jí)數(shù)的擴(kuò)增，具有敏感、快速、特異、無放射性等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)目前已得到了非常廣泛的普及和應(yīng)用。采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)HBV-DNA是目前檢測(cè)HBV-DNA的最佳手段，也是當(dāng)今應(yīng)用最多的一種核酸檢測(cè)（NAT）技術(shù)，其采用完全閉管檢測(cè)，不需后處理，避免了交叉感染，同時(shí)采用實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)連續(xù)不斷的檢測(cè)PCR過程中反應(yīng)體系對(duì)熒光信號(hào)的變化，利用熒光信號(hào)達(dá)到了某一閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)與起始模板DNA量的對(duì)數(shù)值之間的嚴(yán)格的線性關(guān)系，進(jìn)行起始模板定量，定量的準(zhǔn)確率極高，可真實(shí)反應(yīng)HBV的復(fù)制情況。但PCR只能檢出復(fù)制狀態(tài)的病毒，難以表達(dá)非復(fù)制狀態(tài)的感染，因而用PCR方法檢測(cè)HBV-DNA也不能完全代替血清標(biāo)志物的檢測(cè)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，HBV通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原或與細(xì)胞基因整合，誘導(dǎo)免疫損傷甚至細(xì)胞惡變。HBsAg是HBV感染的特異性指標(biāo)，抗-HBs一般于HBsAg消失數(shù)周后（也就是急性感染約5個(gè)月后）開始在血液中出現(xiàn)，是HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性保護(hù)抗體，是HBV感染終止及有免疫力的標(biāo)志。但是，本文單獨(dú)抗-HBs陽性的慢性肝炎組HBV-DNA陽性率為16.67％，提示抗-HBs轉(zhuǎn)陽后，肝細(xì)胞的病毒復(fù)制仍可持續(xù)或者抗體未能消除變異的HBV感染。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HBsAg陰性慢性乙型肝炎患者中，HBV-DNA陽性率為24.44％，提示在HBsAg陰性的慢性乙型肝炎患者，盡管體內(nèi)存在病毒抗體，但隱伏的HBV仍可長(zhǎng)期存在，甚至持續(xù)低水平復(fù)制，因此，僅根據(jù)HBsAg陰性甚至HBsAg陰性、抗-HBs陽性不能排除乙肝感染。兩者檢測(cè)結(jié)果之間的差異可能與以下因素有關(guān)：（1）HBsAg在血液中多為不含病毒顆粒的空殼，其無法反映病毒有無復(fù)制、復(fù)制程度、傳染性強(qiáng)弱等情況，而HBV- DNA檢測(cè)是對(duì)病毒本身的檢測(cè)，是HBV復(fù)制最直接、最可靠的指標(biāo)；（2）部分患者ELISA檢測(cè)有反應(yīng)性，但PCR檢測(cè)為陰性，提示其體內(nèi)仍有病毒顆粒，但可能非完整的病毒顆粒，病毒處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，無明顯的病毒復(fù)制；（3）部分患者ELISA檢測(cè)有反應(yīng)性，但PCR檢測(cè)為陰性，可能與HBV-DNA所用引物不匹配或HBV-DNA整合于宿主細(xì)胞基因或基因變異即HBV- DNA檢測(cè)假陰性，體內(nèi)病毒較低所致。后兩種原因皆提示其傳染性極低。

綜合上述結(jié)果，提示隱匿性乙型肝炎患者仍普遍存在，相當(dāng)部分HBsAg陰性的慢性肝病患者不僅是HBV感染者，而且存在病毒復(fù)制和傳染性。HBsAg隱性感染是隱源性肝病的主要病因之一，也是乙肝疫苗接種無應(yīng)答的原因之一。這就要求我們?cè)谂R床進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，要加強(qiáng)對(duì)患者的篩選，首先應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HBsAg，去除HBsAg有反應(yīng)性血液，再在其基礎(chǔ)上對(duì)HBsAg無反應(yīng)性血液加做HBV-DNA核酸檢測(cè)，去除HBV-DNA有反應(yīng)性血液，只有這樣才能正確診斷患者的機(jī)體感染或復(fù)制狀態(tài)。

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（收稿日期：2009-01-14）