切應(yīng)力對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

孫　陽(yáng)　易　蔚　魏旭峰　易定華　郭樹(shù)忠

[摘要]目的：探討切應(yīng)力作用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(HMSCs)后，對(duì)細(xì)胞增殖的影響。方法：將HMSCs種植于平板流動(dòng)腔中，待貼壁后對(duì)其施加1dyne/cm2的切應(yīng)力作用6h，用MTT法測(cè)細(xì)胞增殖曲線(xiàn)，并用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，計(jì)算增殖指數(shù)。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)HMSCs在1dyne/cm2切應(yīng)力作用6h后，增殖曲線(xiàn)抬高，G2+S期細(xì)胞明顯增加。結(jié)論：HMSCs在切應(yīng)力作用下，增殖能力增強(qiáng)，是組織工程血管種子細(xì)胞的理想選擇。

[關(guān)鍵詞]切應(yīng)力；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；增殖；細(xì)胞周期

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2009）03-0325-03

Shear stress stimulates mesenchymal stem cells proliferation

SUN Yang1, YI Wei2, WEI Xu-feng2, YI Ding-hua2, GUO Shu-zhong1

（1.Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital； 2. Department of Cardiovascular Surgery. The Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi,China）

Abstract：Objective To discover the effect of fluid shear stress on the proliferation of human mesenchymal stem cells (HMSCs). Methods HMSCs were cultured on the bottom of the flow chamber for 1 day before exposure to fluid shear stress，and then exposed to 1 dyne/ cm2 shear stress for 6 h. We can acquire the proliferation curve by means of MTT and gain the cell cycle and cell proliferative index. Results Discovered that under the action of 1 dyne/cm2 shear stress for 6 h, HMSCs improved their capability of proliferation. Conclusion HMSCs gain better ability of proliferation after exposure to shear stress, and they are promising seed cells in the field of tissue engineering blood vessels.

Key words：shear stress; human mesenchymal stem cells;proliferation; cell cycle

臨床工作中常會(huì)遇到患者血管損傷，而自體血管取材受限的問(wèn)題，異體血管存在免疫排斥反應(yīng)，人工血管又容易導(dǎo)致血管栓塞，因此，人們對(duì)組織工程血管給予了更多關(guān)注。內(nèi)皮細(xì)胞作為組織工程血管種子細(xì)胞，取材受限，且無(wú)法發(fā)揮理想的生物學(xué)功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具備增殖能力強(qiáng)，具有多向分化潛能，可逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，取材方便，易于體外培養(yǎng)擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，受到組織工程血管研究的關(guān)注。MSCs作為組織工程血管的種子細(xì)胞，當(dāng)其植入體內(nèi)后必然要面臨血液流體切應(yīng)力的考驗(yàn)，已有研究表明流體切應(yīng)力可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成骨細(xì)胞等的增殖[1-3]，高切應(yīng)力作用亦可促進(jìn)MSCs的增殖[4]，但低切應(yīng)力作用較短時(shí)間（30min）可促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化，卻不能明顯促進(jìn)MSCs的增殖[5]。那么，低切應(yīng)力作用于MSCs較長(zhǎng)時(shí)間后，對(duì)其增殖會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（HMSCs）施加1dyne/cm2切應(yīng)力作用6h后，觀(guān)察細(xì)胞增殖的情況，了解低切應(yīng)力作用于HMSCs較長(zhǎng)時(shí)間后對(duì)其增殖的影響，探討在低切應(yīng)力作用下培養(yǎng)HMSCs是否更利于促進(jìn)其增殖。

1材料和方法

1.1 HMSCs的分離與培養(yǎng)：取人髂骨骨髓（來(lái)自志愿者），PBS稀釋后溶液以300g/min的速度離心5min。棄上清液，再用培養(yǎng)基重懸沉淀，加入到梯度Percoll（Sigma）液中，以900g/min的速度離心20min。吸取交界面白膜層，用PBS重懸細(xì)胞后，以300g/min的速度離心5min，再用含10％FBS（Gibco）的DMEM（Gibco）培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，300g/min離心5min后，棄上清液。加少量含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹勻后置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。24～48h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞。5～6天消化分瓶傳代培養(yǎng)。

1.2 HMSCs表面抗原的鑒定：用2.5g/L 胰蛋白酶消化后收獲第3代細(xì)胞，其分別與抗CD29，CD34，CD45（均購(gòu)自SantaCruz公司）的單克隆抗體飽和溶液在室溫下反應(yīng)30 min，然后用PBS洗滌2次，再與FITC標(biāo)記的二抗避光作用15min。最后用PBS洗滌并重懸于PBS中，對(duì)HMSCs表面抗原進(jìn)行流式分析。

1.3 HMSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞能力鑒定：誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)基由1mM右苯丙胺(Sigma)、0.5mM 3-異丁甲基黃嘌呤(Sigma)、0.1mM吲哚美辛(Sigma)及10mM胰島素組成，HMSCs在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，用10%的甲醛（Sigma）固定1h。然后用60%異丙醇洗滌，再用油紅O染色10min。

1.4 HMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞能力鑒定：誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基由胎牛血清（Gibco）、10-7M地塞米松（Sigma）、0.15mM維生素C (Sigma)及2mMβ-磷酸甘油(Sigma)組成，HMSCs在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天后，用多聚甲醛（Sigma）固定。然后在固定后爬片上作骨鈣素(B＆D)免疫組化染色，以鑒定所培養(yǎng)的HMSCs是否具備分化為成骨細(xì)胞的能力。

1.5 剪切力作用：將經(jīng)過(guò)鑒定的HMSCs種植于平板流動(dòng)腔內(nèi)（寬2.5cm,高0.05cm，長(zhǎng)10cm），置入37℃培養(yǎng)箱24h后，將平板流動(dòng)腔兩端接動(dòng)力裝置管道（體外循環(huán)D型管道），動(dòng)力裝置（Cobe體外循環(huán)機(jī),購(gòu)自美國(guó)）置于培養(yǎng)箱外。調(diào)節(jié)速度至500ml/min, 6h后取出平板流動(dòng)腔，收集細(xì)胞樣本。

1.6 剪切力的計(jì)算：根據(jù)公式τ＝Qη/Sh，τ為剪切力大小，Q為流量500ml/min，η為含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基粘滯系數(shù)0.013Pa·s（37℃），S為平板流動(dòng)腔的橫截面積0.125cm2, h為高度0.05cm，計(jì)算得τ為1dyne/cm2。

1.7 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖曲線(xiàn)：1dyne/cm2切應(yīng)力作用于平板流動(dòng)腔中的HMSCs6h后，分別用胰酶消化切應(yīng)力作用前(對(duì)照組)和作用后（實(shí)驗(yàn)組）的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后種植于96孔板中，待24h細(xì)胞重新貼壁后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各選5孔, 每孔加入20μlMTT,4h后吸除培養(yǎng)基及MTT，再加入二甲基亞砜150μl，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定兩組細(xì)胞在490nm波長(zhǎng)處光吸收值。連續(xù)測(cè)定7天。