射頻緊縮家犬前交叉韌帶后血供重建研究

[摘要] 目的 將射頻能量應(yīng)用于正常家犬前交叉韌帶(ACL)，分析術(shù)后6周和12周的組織學(xué)變化以及固定對它們的影響。方法 將24只成年家犬，隨機分為A、B兩組。A組射頻處理ACL的中間段，B組處理ACL的兩端部。每只家犬雙后肢進行固定和非固定的對比。于6周、12周行血管免疫組化染色。結(jié)果 6周時和12周時，兩端緊縮固定組ACL血管密度高于中間段緊縮固定組，12周時非固定組ACL全部斷裂。結(jié)論 緊縮ACL前半部分的上下端效果較好，射頻處毛細血管從滑膜發(fā)生并向深層生長。ACL射頻術(shù)后有必要進行外固定制動。

[關(guān)鍵詞] 動物實驗; 前交叉韌帶; 射頻; 組織緊縮; 組織學(xué)檢查; 制動; 血管化

[中圖分類號] R873 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)23-05-03

Revascularization Study of Anterior Cruciate Ligament after Radiofrequency Shrinkage in a Canine Model

MA Wenpu ZHAO Jianbin HA Xin GAO Youjuan YUAN Zhenfeng YUAN Xin

Orthopedic Surgery，People’s Hospital of Liaocheng City of Shandong Province 252000，China

[Abstract] ObjectiveTo treat the normal anterior cruciate ligament(ACL) with radiofrequency shrinkage，and then analyze the histologic changes and the impact of immobilization at Weeks 6 and 12 after initial treatment. MethodsTwenty-four skeletally mature canis familiaris were divided into A and B groups randomly. The radiofrequency shrinkage technique was applied in midportion of the ACLs in Group A and in the amph-portions of the ACLs in Group B. We carried out a contrast between the immobility and the non-immobility in the two posterior limbs of each dog. At Weeks 6 and 12 after that，the capillary number was counted in normal ACLs and treated ACLs after FⅧ immunohistochemical histologic examination in every portion. ResultsAt Week 6，the vascularity in amph-portions immobilized groups was higher than that in immobilized midportion group. At Week 12，all the free ACLs in non-immobilized groups ruptured. ConclusionIt may be a better method to shrink the amph-portions of the front portion in the elongated ACL radiofrequency-treatment than to shrink the midportion. The capillary vessels originate from the synovial envelope and invade the radiofrequency-treated parts from the surface toward the deep portion. A period of immobilization is necessary after operation.

[Key Words]Animal study; Aterior cruciate ligament; Radiofrequency energy; Soft-tissue shrinkage; Histological examination; Immobilization; Revascularization

前交叉韌帶(ACL)松弛是運動損傷中的常見疾病，20世紀(jì)90年代及其以前主要以保守治療為主，如肌肉鍛煉、支具保護及限制運動水平等，但效果均不確切[1]。射頻技術(shù)開始被應(yīng)用到肩關(guān)節(jié)不穩(wěn)的治療后在治療ACL松弛方面取得了較好的效果[2，3]，但是也出現(xiàn)了一些并發(fā)癥[4]。關(guān)于ACL射頻緊縮術(shù)的基礎(chǔ)研究較少，而且多數(shù)集中在射頻術(shù)后即時的生物力學(xué)和組織學(xué)的改變方面。射頻術(shù)后的組織學(xué)隨時間變化方面的動物實驗也較少。我們認為，如果想進一步在ACL外科開展射頻技術(shù)，必須由基礎(chǔ)研究提供足夠的動物實驗結(jié)果方面的支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

25只成年家犬，平均體重(16.5±2.2)kg，年齡(4.1±0.7)歲，家犬的體重相近，行走步態(tài)正常，關(guān)節(jié)活動自然。X線攝片確定動物骨骺已經(jīng)閉合。在實驗家犬中隨機選出24只并隨機分為A、B兩組。A組射頻處理ACL的中間段，B組射頻處理ACL的兩端部。A組的每只家犬的一條后肢隨機分入A1組，手術(shù)后進行固定處理;另外一條分入A2組，不做固定處理。B組的每只家犬的一條后肢隨機分入B1組，手術(shù)后進行固定處理;另外一條分入B2組，不做固定處理。另取家犬的正常ACL 6條作為射頻實驗的對照組，和手術(shù)后的ACL一同進行組織學(xué)檢查。

1.2 手術(shù)操作

術(shù)前半小時肌內(nèi)注射安定5mg、速眠新2mL后，雙后肢常規(guī)消毒鋪無菌巾單，取髕前外側(cè)入路，暴露ACL。術(shù)中使用直徑2.5mm射頻汽化儀時，設(shè)定射頻汽化儀為25W。緊縮方式:射頻電極從一個端開始以2.5mm/s速度開始向另一端移動，韌帶每一部分均經(jīng)緊縮，無遺漏，不重疊。按照實驗設(shè)計緊縮處理韌帶的中1/3或者ACL的兩端各1/3，手術(shù)部位的前后方向占韌帶周徑50%～60%。緊縮完成用愛昔康縫線逐層縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，包扎傷口，隨機將一側(cè)膝關(guān)節(jié)用石膏固定于家犬的自然屈膝位置，另一側(cè)則無任何外固定。固定側(cè)三個月后取下石膏固定。每日觀察實驗家犬的的行走步態(tài)是否有異常。正常的步態(tài)應(yīng)該是家犬行走和跳躍時沒有肉眼可見的異常。當(dāng)家犬出現(xiàn)跛行或者一側(cè)下肢向上提起無法負重時認做異常步態(tài)。按照實驗計劃的時間于術(shù)后6周、12周時取出A、B組實驗動物各6條ACL。

1.3 組織學(xué)分析

橫切片行兔抗FⅧ(武漢博士德公司)的免疫組化染色，采用不含一抗的PBS溶液代替一抗作為陰性對照。陽性對照采用已知陽性的家犬的子宮內(nèi)膜標(biāo)本。

微血管計數(shù):每個標(biāo)本有兩個橫切片進行觀察計數(shù)。標(biāo)出橫切片的中心，將中心與鄰接滑膜的韌帶邊緣之間的連線分為三部分，這樣每個橫切片被分為滑膜下部(鄰接滑膜層)、中間部、核心部三部分?；は虏?、中間部各計數(shù)5個200倍鏡視野，核心部計數(shù)3個高倍視野。將每區(qū)所有高倍鏡視野中的計數(shù)平均，然后按面積(mm2)標(biāo)準(zhǔn)化取值代表韌帶橫切片的微血管密度。由三位不知臨床資料的高年資病理醫(yī)師采用背對背方法分別進行，取計數(shù)的平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 11.0處理，分6周和12周利用析因分析對固定與否以及射頻處理韌帶兩端或中間進行檢驗，同時檢驗兩者是否有交互效應(yīng)。利用配對t檢驗及獨立樣本的t檢驗對比分組間的血管密度的差別。當(dāng)P<0.05時有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 步態(tài)觀察及韌帶觀察

家犬出現(xiàn)跛行、關(guān)節(jié)異?；魏秃笾咸o法負重等提示關(guān)節(jié)內(nèi)可能存在ACL功能異常。固定側(cè)后肢未出現(xiàn)異?；顒?，而未固定側(cè)后肢在不同時間內(nèi)出現(xiàn)異常活動。6周時未發(fā)現(xiàn)實驗動物無外固定后肢有異?；顒?。B2組出現(xiàn)關(guān)節(jié)異?；顒拥臅r間為(57±4)d，而A2組出現(xiàn)關(guān)節(jié)異?；顒拥臅r間為(54±5)d，兩者對比無顯著性差異。6周、12周時沿原手術(shù)入路切開暴露ACL后進行觀察。6周時候A1、B1組有鮮亮薄層滑膜包裹形成，集中于射頻部位。A2、B2組滑膜覆蓋散亂，韌帶有部分中斷現(xiàn)象。

2.2 正常ACL組織學(xué)觀察

正常的ACL由一層血管豐富的滑膜覆蓋，血管內(nèi)皮細胞的免疫組化染色顯示在中間段，血管密度如下:滑膜下部(66.0±17.0)/mm2;中間部(40.8±29.3)/mm2;核心部(22.5±9.7)/mm2。ACL脛骨端和股骨端的血管密度無明顯差異，取其平均值表示兩端部血管密度如下:滑膜下部(78.7±17.2)/mm2;中間部(48.8±33.3)/mm2;核心部(25.6±11.2)/mm2。

2.3 微血管計數(shù)

術(shù)后ACL的血管增高區(qū)主要位于射頻處理區(qū)，而韌帶后方未涉及到的后方血管密度無明顯改變(表1)。6周和12周時候，B組ACL股骨端和脛骨端的血管密度無明顯差異，我們?nèi)∑淦骄荡韮啥瞬垦\。而6周時A1、B1組的滑膜下部的血管密度分別明顯強于A2、B2組。經(jīng)析因分析，固定和射頻處理韌帶的兩端均有助于ACL射頻術(shù)后的再血管化，兩者只存在簡單的疊加作用(F=31.098，P=0.000，F(xiàn)=4.485，P=0.047)。12周A1、B1組韌帶的中間部的血管密度較6周前和正常韌帶的血管密度明顯增加，B1組韌帶的中間部的血管密度高于A1組。韌帶的核心部血管密度無明顯改變。分析對比6周、12周時候A1、B1組每組中三個分區(qū)的的血管密度。發(fā)現(xiàn)韌帶的血管密度在6周、12周時滑膜下部明顯大于中間部，但在12周時這種差距減小。

3 討論

射頻技術(shù)在外科的應(yīng)用越來越受到重視。自1998年Thabbit[3]將射頻技術(shù)第一次應(yīng)用到ACL松弛的緊縮治療后，陸續(xù)有關(guān)于這項技術(shù)并發(fā)癥[4]的報道，另有研究者對這項技術(shù)提出了質(zhì)疑[5]。目前缺乏關(guān)于射頻技術(shù)對ACL治療的基礎(chǔ)研究。

射頻術(shù)后ACL的生物力學(xué)強度下降，如果不受保護將有斷裂的危險。Lopez等[6]將正常家犬的一側(cè)后肢ACL進行射頻處理，術(shù)后未施行任何保護措施，約55d后觀察到ACL斷裂的征象。實驗中我們將射頻處理后家犬的后肢分為石膏固定側(cè)和不固定側(cè)，然后將家犬飼養(yǎng)在家犬舍中。術(shù)后60d左右未固定后肢均出現(xiàn)ACL斷裂后異常步態(tài)，而固定側(cè)未出現(xiàn)。這說明石膏管型起到了限制關(guān)節(jié)屈伸的作用，有利于術(shù)后ACL的組織修復(fù)。術(shù)后負重并不是ACL射頻緊縮術(shù)后的禁忌，而限制關(guān)節(jié)的過度屈伸，維持關(guān)節(jié)的穩(wěn)定才是關(guān)鍵。

良好的組織血運是組織修復(fù)再生的前提。韌帶受損后的再血管化對韌帶膠原的生成以及組織塑形都是非常重要的。Hsiao-Li Ma等[7]發(fā)現(xiàn)緊縮過程會破壞韌帶表層的血管網(wǎng)及其包裹滑膜。而這些血管和滑膜正是提供韌帶營養(yǎng)的根源。在韌帶經(jīng)受射頻處理后，其必將適應(yīng)新的環(huán)境，韌帶纖維重新生長、重塑，血管重新長入。固定組的ACL 6周時在射頻處理區(qū)域的微血管生成集中在韌帶的表層，即韌帶的滑膜下層，而在12周時韌帶的中間部的微血管密度增大，滑膜下層的微血管密度開始降低(圖1)。這一動態(tài)的觀察說明，在術(shù)后的前幾周，射頻處理區(qū)域的血管長入是從覆蓋韌帶的滑膜開始的(圖2)，在固定組，兩端射頻處理后ACL的血管化要優(yōu)于中間射頻處理的ACL。

學(xué)者們認為在韌帶受后的修復(fù)過程中，韌帶的脂肪墊、滑膜起到了重要的作用，當(dāng)切除髕前脂肪墊后，韌帶的血管化明顯延遲[8]。Unterhauser等[9]在羊的自體肌腱重建ACL的研究中認為，韌帶的血管化首先應(yīng)當(dāng)是韌帶周圍的滑膜生長。Scheffler等[10]在羊的ACL射頻處理術(shù)后的組織學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)韌帶的新生血管集中在滑膜下層和中間部。但是其未形成連續(xù)的觀察過程。血運豐富、脂肪墊覆蓋較好的兩端在經(jīng)受射頻處理后韌帶的再次血管化的密度以及組織重塑的速度都要好于韌帶的中間段，這說明韌帶血運豐富的地方有較好的組織修復(fù)能力。

綜合以上，我們認為射頻處理后的韌帶的再血管化必須在適當(dāng)?shù)耐夤潭ǖ那闆r下才能進行，它的血管化的模式是由滑膜向韌帶射頻滲透區(qū)域進行的，韌帶兩端的再血管化優(yōu)于韌帶的中間部分。去除手術(shù)適應(yīng)證的選取問題，我們認為術(shù)中的緊縮方式對術(shù)后恢復(fù)也有較大影響。我們在實驗中韌帶的緊縮從韌帶的兩端向韌帶中間進行，緊縮范圍不重疊，盡量余留較多的韌帶中段，余留韌帶后面的50%左右不緊縮。一旦術(shù)中檢查到膝關(guān)節(jié)的前抽屜試驗和Lachman試驗變?yōu)殛幮裕涂梢酝Ｖ咕o縮。當(dāng)然這種緊縮方式還需要足夠的臨床證據(jù)支持。在將來進一步的研究中，我們想找到合適的方法創(chuàng)建ACL部分損傷松弛模型，并進行生物力學(xué)方面的實驗。同時根據(jù)實驗結(jié)果和臨床觀察，制定出緊縮術(shù)后的具體的康復(fù)方案。

4 結(jié)論

緊縮ACL前半部分的上下端效果好于緊縮處理ACL中1/3，有利于組織再血管化和重塑。在ACL的射頻處理部位，毛細血管從滑膜開始發(fā)生向射頻處理部位的深層生長。ACL射頻術(shù)后有必要進行一定時間外固定制動，制定詳細的術(shù)后鍛煉以及保護措施，以利于組織修復(fù)。

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(收稿日期:2009-03-16)